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香茅醛,即3,7-二甲基-6-辛烯醛,分子中含有一个手性碳原子,因而具有(R)和(S)两种构型。香茅醛具有强烈的青柑橘和微带木香的香气,因而被广泛用于食品的加香和配制,其中,(R)-香茅醛是合成重要香料L-薄荷醇的关键前体。目前,工业上主要采用化学催化方法合成(R)-香茅醛,如日本高砂(Takasago)公司发明的手性BINAP-Rh+配位催化剂不对称催化香叶基胺合成(R)-香茅醛,以及德国巴斯夫(BASF)公司发明的(Z)-柠檬醛的选择性氢化。前者催化剂的制备条件苛刻且回收利用困难,后者需要通过精馏(E/Z)-柠檬醛获得高纯度的(Z)-柠檬醛,且使用了含重金属的特制合成催化剂。相比于化学催化,烯键还原酶催化柠檬醛不对称还原合成香茅醛的方法具有环境友好、反应条件温和、产物立体选择性高等优点。但是,目前报道的能够高选择性、高活性催化(E/Z)-柠檬醛合成(R)-香茅醛的烯键还原酶非常少,大部分的烯键还原酶催化柠檬醛时倾向于生成(S)-香茅醛。本论文以构建高效的(R)-香茅醛生物合成体系为目标,筛选能够高选择性催化(E/Z)-柠檬醛生成(R)-香茅醛的烯键还原酶,并对其进行酶学性质研究;针对目前全细胞催化过程中的副反应问题,构建合适的细胞催化剂和全细胞催化反应体系。具体研究内容如下:一、对柠檬醛具有(R)-对映体选择性的烯键还原酶的筛选及其酶学性质研究以天然的(E/Z)-柠檬醛(反式:顺式=9:10)为底物,从23个不同来源的烯键还原酶中,筛选到来源于Saccharomyces cerevisiae YJM1341的NAD(P)H依赖的烯键还原酶OYE2p,展现出最高的对映体选择性(84.5%)。酶学性质研究表明,OYE2p的最适温度为40 ℃,最适pH为7.5,在30 ℃以下和偏碱性(pH 7-9)环境中较稳定。通过对其底物谱的研究发现,OYE2p对于碳碳双键附近带有两个吸电子基团的化合物如马来酰亚胺、N-苯基马来酰亚胺、茶香酮以及马来酸二甲酯具有很高的酶活。二、烯键还原酶OYE2p催化柠檬醛的对映体选择性的影响因素和酶催化(E/Z)-柠檬醛合成(R)-香茅醛的研究对于柠檬醛的两种异构体,OYE2p对(E)-柠檬醛(顺式,香叶醛)和(Z)-柠檬醛(反式,橙花醛)表现出不同的对映体选择性。OYE2p对(E)-柠檬醛(顺式,香叶醛)表现出严格的(R)-对映体选择性,产物(R)-香茅醛的ee值>99%,且不受环境pH的影响;OYE2p催化橙花醛时倾向于生成(R)-香茅醛,但也生成(S)-香茅醛,而且产物的eeR随着pH值的增大而增大。对于(E)、(Z)-柠檬醛,OYE2p在pH7.6条件下表现最高的催化活性。基于上述结果,伴随葡萄糖脱氢酶催化的辅酶NAD(P)H再生反应,利用OYE2p催化200 mM香叶醛合成了光学纯的(R)-香茅醛,产物ee值为98%(R),底物转化率为大于99%,产率为87.03%;当以200 mM的(E/Z)-柠檬醛作为底物时,产物的ee值为89%(R),底物转化率为98.4%,产率为87.2%。三、OYE2p与甲酸脱氢酶(FDH)的共表达及全细胞催化(E/Z)-柠檬醛合成(R)-香茅醛的研究考虑到辅酶循环的复杂性、酶的稳定性和制备成本等问题,构建OYE2p和FDH(催化辅酶NADH再生)共表达的E.coli细胞催化剂,采用全细胞催化(E/Z)-柠檬醛合成(R)-香茅醛。研究发现,重组E.coli全细胞催化柠檬醛的反应过程中,在柠檬醛分子上的碳碳双键被还原生成香茅醛的同时,柠檬醛和生成的香茅醛分子上的醛基还会被细胞内竞争性的NAD(P)H依赖的羰基还原酶还原为香叶醇、橙花醇、香茅醇等副产物;此外,生成的香茅醛也会被进一步降解或代谢。本研究选择了 2种不同的连接肽,构建了 2种OYE2p与FDH融合表达的E.coli细胞催化剂。其中,融合表达菌E.coli(pET21d-fdh-(ggggs)3-oye2p)中融合蛋白的表达量以及OYE2p、FDH的酶活力最高。有趣的是,利用该菌全细胞催化柠檬醛过程中没有羰基还原副反应的发生。主要原因是,融合表达加强了 OYE2p与FDH的空间临近效应,使辅酶在二者间循环,细胞内的竞争性的羰基还原酶因得不到足够的辅酶NAD(P)H而无法表现活性。此外,通过建立甲苯(20%v/v)-PBS缓冲液两相反应体系,避免了产物香茅醛的进一步降解,实现了产物的有效积累。