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背景脑梗死不仅会造成神经元的死亡,还会诱导免疫系统发生显著改变。免疫反应的强弱决定了脑梗死的发展及预后走向。骨髓是构成免疫系统的重要成分之一,是最为重要的中枢免疫器官,主要通过生成及释放免疫细胞的方式调控外周免疫反应。调节性T(regulatory T,Treg)细胞是一群以表达Fox P3基因为特征的T淋巴细胞,为骨髓执行免疫功能的核心成分之一,占骨髓CD4+淋巴细胞的1/3以上,通过控制效应细胞的数量与分泌功能发挥免疫调节作用。由于骨髓Treg细胞的占有比例和细胞的免疫抑制力均显著高于循环、脾脏和胸腺的Treg细胞,无论是其数量还是功能变化都将对免疫相关疾病如类风湿性关节炎、抗移植物宿主病等产生重要的影响。骨髓Treg细胞已成为治疗免疫相关疾病的重要靶点。然而,骨髓Treg细胞的数量和功能在脑梗死后发生何种变化以及这种变化具有何种作用尚不清楚。骨髓细胞的生物学行为受大脑发出的交感神经纤维(SNS)调控。脑炎可活化SNS并通过骨髓内的β-肾上腺素受体(β-AR)促进前列腺素E2(PGE2)的分泌。而PGE2是促进CD4+CD25-细胞转为Treg细胞的关键因子,前列腺素受体-4(EP4)是该过程的主要受体。PGE2-EP4通路下游的主要效应分子是核因子κB受体活化因子配体(RANKL),因为RANKL直接作用于CD11C+树突状细胞(DCs)的核因子κB受体活化因子(RANK),通过增加转化生长因子-β的分泌后诱导Treg细胞的形成。RANKL促使Treg细胞扩增的作用已被广泛证实。系列研究表明,骨髓CD4+细胞高表达EP4且有分泌RANKL的能力,DCs围绕CD4+分布。基于前述研究,我们猜想:脑梗死可能会活化SNS并通过β-AR加强PGE2/EP4-RANKL信号,增加Treg细胞的数量并加强其免疫抑制功能。迁移是Treg细胞执行免疫功能的先决条件。在生理状态下,骨髓Treg细胞的浓度显著高于外周,主要是由于Treg表达的CXCR4与骨髓基质表达的SDF-1结合后被滞留于骨髓腔所致。关于SNS调节骨髓细胞的研究提示,骨髓交感神经纤维末梢在不间断释放去甲肾上腺素(NE)。当骨髓内的NE达到生物学浓度时,β3-AR信号被活化并将SDF-1降解,引起CXCR4+细胞迁移出骨髓。因此,我们设想脑梗死活化的SNS是否会通过β3-AR信号通路促使CXCR4+Treg细胞从骨髓迁移至与外周。脑梗死最为重要的并发症是肺部感染,是脑梗死后期最为重要的死因。脑梗死相关免疫抑制被认为是肺部感染的重要原因,具体表现为T淋巴细胞、单核细胞的功能失活和数量下降,抗感染因子干扰素γ显著减少等。如前所述,Treg细胞具有肯定的免疫抑制功能,但骨髓Treg细胞是否参与脑梗死相关免疫抑制过程尚不清楚。目的研究骨髓Treg细胞在脑梗死后的数量、功能变化以及涉及到的相关分子机制,并探讨这种变化的临床作用。方法1.将雄性C57BL/6小鼠分为假手术组,溶剂处理组和药物处理组;采用线栓法制备大脑中动脉闭塞模型。2.采用Western blot观察骨髓SNS活化标志物酪氨酸羟化酶(TH)、PGE2合成限速酶COX-2以及SDF-1的变化,同时利用流式细胞术分析骨髓Treg细胞的数量改变;然后使用6-OHDA毁损SNS后再观察前述指标的变化,评价SNS信号是否涉及到骨髓Treg细胞数量、COX-2和SDF-1表达的变化。3.利用特异性阻断剂分别阻断β2-AR、β3-AR信号后,研究何种受体在Treg细胞数量、COX-2、SDF-1变化中发挥了关键作用。4.阻断COX2/PGE2、EP4、RANKL信号,观察Treg细胞数量变化,论证COX2/PGE2、EP4、RANKL与Treg数量变化的因果关系。5.分离出Treg细胞,通过共培养实验、Transwell实验和Q-PCR对比研究不同来源的骨髓Treg细胞免疫抑制力、迁移能力和Fox P3表达的差异。最后阻断引起骨髓Treg细胞变化的关键通路,观察外周Treg细胞数量和肺部感染程度的变化,明确骨髓Treg细胞与脑梗死相关免疫抑制的关系。6.数据以均数±标准差表示,使用单因素方差分析进行统计,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.脑梗死快速激活骨髓的SNS(TH于MCAO术后6h显著增高),并增加Treg细胞的数量、上调COX-2的表达,抑制SDF-1的分泌(P<0.05);使用6-OHDA毁损SNS能阻止脑梗死对骨髓Treg细胞及分子成分的改变(P<0.05)。2.采用布托沙明阻断β2-AR信号将抑制骨髓Treg细胞、COX-2的增加(P<0.05),但是对SDF-1无影响(P>0.05);采用SR59230A阻断β3-AR信号抑制了SDF-1的减少(P<0.05),但是却对COX-2的表达无影响(P>0.05),说明β2-AR信号在脑梗死后骨髓的扩增和COX-2的上调过程中发挥了关键作用,而β3-AR信号可能涉及到骨髓Treg细胞的迁移。3.采用吲哚美辛抑制COX-2的酶活性或利用L-161,982封闭EP4信号能显著减少脑梗死后骨髓Treg细胞数目、RANKL的表达(P<0.05),说明PGE2-EP4信号在促进Treg细胞的扩增和RANKL的表达中发挥了关键作用;采用OPG封闭RNAKL信号也能减少脑梗死后骨髓Treg细胞的数量(P<0.05),说明PGE2-EP4信号通过上调RANKL的表达促进骨髓Treg细胞的扩增。4.体外实验显示,正常小鼠骨髓Treg细胞(Nor BM-Treg)对效应T淋巴细胞(Teff)的抑制力及Fox P3的表达水平均明显高于脾脏Treg细胞(Nor Sp-Treg)(P<0.05),脑梗死(7d)小鼠骨髓Treg细胞(Isc BM-Treg)的免疫抑制力及Fox P3的表达水平均明显高于前述两者(P<0.05);然而,取自注射了OPG(封闭RNAKL)的脑梗死小鼠骨髓Treg细胞(Isc BM-OPG-Treg)的免疫抑制力和Fox P3表达水平明显低于Isc BM-Treg细胞(P<0.05),接近Nor BM-Treg细胞的水平(P>0.05),但迁移能力与Isc BM-Treg相近(P>0.05),这说明RANKL信号介导了脑梗死后骨髓Treg细胞免疫抑制功能的增加,SNS通过其他通路增强了骨髓Treg细胞的迁移能力。此外,采用OPG抑制骨髓Treg细胞的扩增或阻断Treg细胞的外迁均能显著减少脑梗死小鼠的肺部菌落数(MCAO术后7d)。结论1.脑梗死活化的SNS通过β2-AR信号促进骨髓Treg细胞数量增的加及免疫抑制力的加强。2.SNS扩增的骨髓Treg细胞的迁移能力明显增强。3.脑梗死活化的SNS通过β3-A信号促使骨髓Treg细胞迁移至外周,参与了脑梗死后期相关免疫抑制过程,促进了肺部感染。