盐分对植物的伤害主要是Na~+引起的,而Na~+/H~+逆向转运蛋白催化Na~+和H~+的逆向跨膜运输,是植物抵御盐胁迫的主要方式之一,在植物耐盐性方面起着重要的作用。对于植物Na~+/H~+逆向转运蛋白基因的克隆、表达及功能的分析将对植物耐盐基因工程产生重要意义。通过GenBank上登录的其它植物液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因的同源序列设计一对简并引物,利用RT-PCR和RLM-RACE技术获得了菊芋液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因的cDNA全序列,命名为HtNHX1。HtNHX1 cDNA全长2148bp,5′端非编码区长269bp,3′端非编码区长501bp,含有1个可能的加polyA信号:AATAA,开放阅读框含有1647个核苷酸,编码一个由549个氨基酸构成的多肽,并且含有Na~+/H~+逆向转运蛋白的高度保守序列LFFIYLLPPI,这是Na~+/H~+逆向转运蛋白活力的竞争性抑制剂氨氯吡嗪嘧的结合位点。HtNHX1的氨基酸序列与已克隆的花花柴KcNHX2、水稻OsNHX2、莲花NcNHX1、矮牵牛PhNHX1、牵牛花InNHX2、玉米ZmNHX5的Na~+/H~+逆向转运蛋白具有很高的同源性,分别为80%,74%,72%,74%,74%,70%。同时根据RLM-RACE的原理和5′端非编码区序列的分析,推测出目的基因上游的转录起始位点可能为a,为该基因表达调控方面的研究奠定了基础。根据HtNHX1基因全长序列设计引物扩增其编码区,并将其克隆到pUC19载体中,经测序确认,保留未发生突变的克隆体,用于构建其植物表达载体pBI121-HtNHX1。冻融法将pBI121-HtNHX1重组质粒导入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404中,获得工程菌LBA4404-pBI121-HtNHX1。农杆菌介导法将HtNHX1基因编码区导入烟草(Nictiana tabacum L.cv.89),获得卡那霉素抗性植株。PCR、RT-PCR均证明外源HtNHX1基因已整合到烟草基因组中。转基因烟草具有一定的耐盐性,能在含200 mmol/L NaCl的培养基中正常生长2周,而对照则在100 mmol/L NaCl处理时便不生根。