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目的:本课题选取云南省名中医李庆生教授治疗慢性便秘的有效临床验方-养阴益气润肠方(YYRD)对慢传输型便秘(STC)模型大鼠进行干预,观察其对模型大鼠肠道菌群、短链脂肪酸、结肠Cajal间质细胞(ICCs)、血浆5-羟色胺(5-HT)和血管活性肠肽(VIP)的影响,探讨其是否通过改善肠道菌群和肠道动力缓解慢传输型便秘,从而初步阐述养阴益气润肠方通便作用的分子机制,为临床应用提供实验依据和理论支持。方法:1.复方地芬诺酯复制STC大鼠模型,通过观察大鼠肠道炭末推进率、粪便含水率、结肠组织病理改变等指标变化评价模型复制是否成功。2.制备养阴益气润肠方水煎液,复方地芬诺酯持续灌胃7天以复制模型,从第8天始,继续造模的同时以灌胃给药的方式开始药物干预,阳性药物组大鼠予双歧杆菌乳杆菌三联活菌片(金双歧,LCBL)灌胃,给药7天后杀鼠取材以检测指标。3.指标检测。(1)药物疗效评价指标:通过炭末推进试验检测大鼠肠道炭末推进率,通过烘干法检测大鼠粪便含水率;通过HE染色观察大鼠结肠病理学改变。(2)肠道动力相关指标:通过免疫组化法检测结肠组织Cajal间质细胞的表达;通过酶联免疫吸附测定法检测大鼠血浆5-羟色胺和血管活性肠肽的含量。(3)肠道菌群相关指标:通过16S rDNA测序法检测大鼠肠内容物的菌群结构和丰度;通过气相色谱法检测大鼠肠道菌群代谢产物-短链脂肪酸的含量。结果:1.养阴益气润肠方可加强肠道推进运动、增加粪便含水率和改善结肠组织病理。(1)养阴益气润肠方对大鼠肠道炭末推进率的影响:与空白组相比,模型组大鼠肠道炭末推进率显著下降(P<0.01)。与模型组相比,各药物组大鼠肠道炭末推进率显著上升,且差异均有统计学意义。(2)养阴益气润肠方对大鼠粪便含水率的影响:与空白组相比,模型组大鼠粪便含水率下降较为明显。与模型组相比,各药物组的粪便含水率上升。(3)养阴益气润肠方对大鼠结肠组织病理的影响:与空白组相比,模型组大鼠结肠组织黏膜部分脱落,肌层稍变薄,杯状细胞数量减少。与模型组相比,各药物组大鼠结肠组织黏膜脱落情况和肌层厚度改善,杯状细胞数量增多。2.养阴益气润肠方可通过提高大鼠结肠组织Cajal间质细胞(ICCs)的表达,以及调节5-羟色胺(5-HT)和血管活性肠肽(VIP)的含量促进肠道运动。(1)养阴益气润肠方对大鼠结肠组织ICCs的影响:与空白组相比,模型组大鼠结肠c-kit阳性表达细胞数明显减少(P<0.01),表明结肠中ICCs的数量显著减少。与模型组相比,各药物组的c-kit阳性表达细胞数显著增加,且差异均有统计学意义,表明结肠中Cajal间质细胞的数量增多。(2)养阴益气润肠方对大鼠血浆5-HT和VIP含量的影响:与空白组相比,模型组大鼠5-HT含量显著下降(P<0.01)。与模型组相比,各药物组大鼠5-HT含量均显著上升,且差异均有统计学意义。与空白组相比,模型组大鼠VIP含量显著上升(P<0.05)。与模型组相比,养阴益气润肠方各剂量组大鼠VIP含量显著下降,且差异均有统计学意义;阳性药物组大鼠VIP含量呈下降趋势(P>0.05)。3.养阴益气润肠方可改善大鼠肠道菌群的结构及其代谢产物-短链脂肪酸的含量。(1)养阴益气润肠方对大鼠肠道菌群结构的影响:在门水平上,模型组大鼠肠道菌群以Firmicutes(厚壁菌门)为主的7个菌门相对丰度增加,以Bacteroidetes(拟杆菌门)和Proteobacteria(变形菌门)为主的5个菌门相对丰度减少。中药中剂量组大鼠以Firmicutes(厚壁菌门)和Proteobacteria(变形菌门)为主的3个菌门相对丰度增加,以Bacteroidetes(拟杆菌门)为主的8个菌门相对丰度减少。在属水平上,模型组大鼠肠道菌群以Bacteroides(拟杆菌属),Prevotella(普雷沃菌属),Blautia(布劳特氏菌)等为主的12个菌属相对丰度增加,以Oscillospira(颤螺旋菌属),Lactobacillus(乳杆菌属)和Coprococcus(粪球菌属)为主的8个菌属相对丰度减少。中药中剂量组大鼠以Phascolarctobacterium(考拉杆菌属)和Oscillospira(颤螺旋菌属)为主的11个菌属相对丰度增加,以Bacteroidetes(拟杆菌属)为主的8个菌属相对丰度减少。基于属水平的物种相对丰度,筛选出养阴益气润肠方各剂量组的差异菌群,主要包括Clostridium(梭菌属)、Alistipes(另枝菌属)、Treponema(密螺旋体菌属)、Staphylococcus(葡萄球菌属)、Turicibacter。结果提示,养阴益气润肠方可增加Clostridium(梭菌属)、Alistipes(另枝菌属)等具有潜在的促进肠蠕动作用菌属的相对丰度以及降低Treponema(密螺旋体菌属)、Staphylococcus(葡萄球菌属)、Turicibacter等条件致病菌的相对丰度。(2)养阴益气润肠方对大鼠肠内容物短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸)含量的影响:与空白组相比,模型组乙酸、丙酸的含量明显升高,且差异均具有统计学意义;丁酸的含量呈下降趋势(P>0.05);与模型组相比,养阴益气润肠方中剂量组丙酸、丁酸的含量呈上升趋势(P>0.05)。结论:1.养阴益气润肠方可通过促进结肠Cajal间质细胞的表达,增加5-羟色胺和降低血管活性肠肽的含量,从而促进肠道蠕动,提高肠道动力,缓解慢传输型便秘。2.养阴益气润肠方可通过调节慢传输型便秘大鼠的肠道菌群平衡和短链脂肪酸的含量,改善肠道的慢传输状态。3.养阴益气润肠方对肠道菌群失调和肠道动力障碍的改善是其防治慢传输型便秘的机制之一。