一、研究背景:近年来,四肢大段骨缺损的修复重建取得了巨大进步,但仍然是困扰骨科医生的主要难题之一,理想的治疗目标不仅要实现骨缺损的快速愈合,同时要减少对患者的不利影响,最后恢复患肢的功能。目前经典的重建方法包括自体松质骨移植,Ilizarov技术以及带血管腓骨移植技术,这些方法在四肢骨缺损修复重建过程中取得了巨大的成功,至今仍发挥着不可或缺的作用,但这几种骨重建技术存在一定的局限性仍需要改进。自体松质骨移植仅适用于修复4-6cm以内的骨缺损,否则移植骨可能被吸收导致骨重建失败。骨搬移技术治疗周期较长,患肢佩戴大体积的外固定架对患者的日常生活影响较大,治疗过程极为痛苦,患者不易耐受。带血管腓骨移植技术对修复大段骨缺损具有一定优势,但是对设备和技术要求较高,还容易出现骨连接不正、骨延迟愈合或不愈合、供骨区和受骨区同时失败的风险和并发症[1-3]。2000年Masquelet等[4]报道了膜诱导技术治疗四肢节段性骨缺损,因为具有成功率高、并发症少、操作简单等优势逐步被越来越多的骨科医师所认可。该技术治疗骨缺损主要通过两期手术完成,首先对骨缺损及周围清创,去除感染、坏死的组织,局部填塞聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethyl Methacrylate PMMA)骨水泥诱导周围形成一层具有生物活性的膜,称为诱导膜,二期(6-8周后)在膜内植入颗粒状自体松质骨修复骨缺损。早期研究显示该技术修复骨缺损成功率高达88%~100%,能够成功修复长达25cm的骨缺损[5-7]。目前认为膜诱导技术治疗四肢骨缺损成功率高的关键因素是骨水泥诱导形成的生物膜,它不仅能维持移植骨的形态,防止移植骨被周围组织吸收,同时能为移植骨成骨提供必须的血供及多种成骨生长因子,包括骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)等[5]。诱导膜能够促进自体松质骨修复骨缺损,在两端骨髓腔封闭的情况下它能否为灭活移植骨提供必需的细胞、血供及生长因子修复骨缺损尚不清楚,同时诱导膜中生长因子含量随时间的变化情况亦不明确,这对二期植骨时间的选择具有重要指导意义,诱导膜与骨膜促成骨活性的异同还有待研究。本研究通过在动物体内建立骨缺损-诱导膜模型,在封闭的诱导膜内植入灭活自体移植骨材料以期修复骨缺损,进而在不同时间点取出诱导膜、骨膜组织,观察诱导膜的结构、生长因子含量随时间的变化情况,同时将不同时间点的诱导膜及骨膜蛋白提取液在体外与间充质干细胞进行培养,观察干细胞增值、分化情况,从而与骨膜进行比较,初步探讨诱导膜促进灭活自体骨成骨的机制。二、研究目的1、构建兔骨缺损诱导膜模型,膜内植入灭活骨观察诱导膜能否促进灭活移植骨修复骨缺损;2、通过组织切片染色及elisa蛋白定量分析诱导膜主要生长因子随时间的变化情况,以寻找最佳植骨时间;3、提取诱导膜和骨膜的蛋白液与间充质干细胞培养比较它们的促成骨能力。三、材料和方法1.第三军医大学动物实验中心提供新西兰大白兔24只,雌雄不限,体重(2.35±0.12)kg,实验兔一期在双侧桡骨中段制造1.5cm骨缺损,随后填塞聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)骨水泥诱导生物膜形成,6周取出骨水泥进行二期处理,按随机数字表法将实验兔随机分为实验组、模型组和对照组,并根据分组进行不同的处理,每组8只。实验组保留诱导膜并在诱导膜内植入经高温水浴灭活(100℃30min)的自体松质骨,模型组保留诱导膜不植骨,对照组小心去除诱导膜后植入自体灭活骨(100℃30min)。常规条件饲养8、12周后通过放射学检测和组织学检测评估新生骨形成情况。2.健康成年新西兰大白兔32只,在动物手术室无菌条件下将新西兰大白兔双侧桡骨制造1.5cm骨缺损,同期植入聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)骨水泥2g,缝合手术切口,常规条件下饲养。2、4、6、8周后取出骨水泥,仔细分离周围包裹的诱导膜,同时分离正常骨膜(peristeum)以及肌外膜(epimysium)进行比较,不同时间点诱导膜组织、骨膜、肌外膜具体检测项目如下:①将三种膜组织用甲醛固定后行he染色,观察诱导膜组织结构随时间变化情况并与骨膜作比较。②提取膜蛋白组织进行elisa检测血管内皮生长因子vascularendothelialgrowthfactor(vegf),血管紧张素-2angiotensinii(angii),骨形态发生蛋白-2bonemorphogeneticprotein2(bmp2),成纤维生长因子-2fibroblastgrowthfactor2(fgf2),前列腺素e2prostaglandine2(pge2)含量及其随时间的变化情况,③提取膜组织蛋白液与间充质干细胞培养,检测干细胞增殖和分化,同时尝试分离鉴定诱导膜中贴壁生长细胞。四、结果1.实验兔骨缺损重建模型放射学检测可见二期处理后第8周、12周实验组中新生骨形成明显优于对照组和模型组(P<0.01),模型组可见少许骨痂形成,对照组未见新生骨形成;第8、12周组织学切片中观察实验组可见软骨细胞形成和骨细胞,成骨明显优于模型组和对照组(P<0.01),对照组仅可观察到纤维连接,未见骨性连接和骨细胞。2.组织切片HE染色结果显示诱导膜和骨膜均含有分界明显的两层,内层含丰富的血管组织,外层为成纤维和胶原层,2周诱导膜组织水肿明显,中性粒细胞多,炎症反应最明显,血管最丰富,4周后诱导膜的厚度以及血管含量随时间逐渐减小并趋于成熟,同时在诱导膜切片HE染色中观察到软骨内骨化。3.三种膜蛋白提取液ELISA检测结果显示肌外膜中每个时间点各种蛋白含量均较低,诱导膜中的BMP-2、VEGF含量第6周达到高峰,在第6周诱导膜BMP-2的含量高于骨膜(P<0.05),其余时间点跟骨膜接近。6周诱导膜中VEGF含量接近骨膜,其余时间点均低于骨膜。诱导膜中FGF2、ANG-II在第4周达到高峰后开始下降,骨膜中FGF-2一直处于较高水平,在4周和诱导膜含量接近,诱导膜中ANG-II一直高于骨膜和肌外膜,肌外膜和骨膜ANG-II没有统计学差异(P>0.05)。检测发现诱导膜中PGE2的含量随时间改变没有明显的变化,诱导膜与骨膜和肌外膜之间也无统计学差异(P>0.05)4.三种膜标本对间充质干细胞增殖实验结果表明间充质干细胞在肌外膜蛋白提取液的培养基中一直处于较低增殖水平,第2、8周诱导膜促进间充质干细胞增殖能力跟骨膜接近(P>0.05),第4、6周诱导膜刺激细胞增殖能力大于骨膜(P<0.05),间充质干细胞成骨分化通过检测碱性磷酸酶活性来评价。结果表明第2、8周诱导膜蛋白提取液促进间充质干细胞成骨分化方面低于骨膜(P<0.05),在第4、6周诱导膜和骨膜培养基中ALP活性接近,第4、6周诱导膜促进干细胞增殖作用最强,同时第4周诱导膜ALP活性高于其他时间点。骨膜和成熟诱导膜对间充质干细胞增殖和成骨分化促进作用相当。我们分离培养得到CD44+贴壁细胞在诱导剂条件下能向成骨方向分化,五、结论1.诱导膜在植入骨水泥后4-6周主要成骨相关生长因子含量最高,成骨能力最强,此时是最佳的植骨时间;2.诱导膜生长因子含量及促成骨活性与骨膜接近;3.诱导膜能为移植骨提供生长因子和细胞从而促进灭活移植骨成骨。