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背景:刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性有核细胞内寄生的原虫。绝大多数恒温动物包括人类感染后可以导致弓形虫病。正常人感染后,一般无明显症状,引起隐性感染。当隐性感染者免疫功能受破坏或者免疫低下时（如肿瘤病人长期化疗,器官移植患者,艾滋患者等）会使慢性弓形虫活化,而使得弓形虫在体内大量增值,引起严重的弓形虫病甚至死亡。当孕妇感染时,其免疫功能低下,尤其在孕早中期,会使得弓形虫通过胎盘垂直传播给胎儿。同时弓形虫感染孕妇时,可激活蜕膜免疫细胞,造成对胎儿的排斥和杀伤,从而引起胎儿宫内发育受限,流产,死胎以及胎儿的先天性弓形虫病等不良妊娠结局。当机体感染弓形虫时,巨噬细胞是抗弓形虫感染的最敏感的细胞,同时也是急性感染全身播散的主要途径。正常妊娠中,占白细胞总数的20%-30%的单核巨噬细胞在维持正常妊娠中发挥重要作用。最近研究表明,正常妊娠时巨噬细胞以旁路途径激活的巨噬细胞型（alternatively activated macrophage,M2）存在,维持母体和胎儿界面免疫抑制的微环境维持正常妊娠。当机体抗弓形虫感染时,诱导蜕膜巨噬细胞从M2向M1（classically activated macrophages,M1）方向偏移,从而打破了正常妊娠时母胎界面免疫耐受的生理平衡,改变了母胎界面的微环境,从而引起了严重的不良妊娠结局。本实验室前期保存有I型基因型的RH WT株,并利用CRISPR-Cas9技术成功构建了rop16Ⅰ/Ⅲ基因缺陷虫株RHΔrop16。本次实验运用RHΔrop16虫株感染孕鼠,观察分析母胎界面免疫相关细胞和细胞因子,研究敲除ROP16后,RHΔrop16虫株诱导蜕膜巨噬细胞的免疫偏移情况及其在弓形虫感染致不良妊娠结局中的作用。目的:本实验旨在研究I型弓形虫RH株与RH△rop16株感染孕鼠后蜕膜巨噬细胞的偏移情况,揭示效应分子ROP16在母胎界面诱导的M2偏移及其对不良妊娠结局的的影响及其机制,为解释ROP16的免疫调节作用以及在孕妇弓形虫病的发病机制、预防和治疗提供新的思路和策略。方法:利用C57BL/6小鼠按照雌鼠和雄鼠2:1的比例构建孕鼠模型,设置正常对照组,在小鼠孕7.5天,注射200μl无菌PBS。感染组在孕7.5天注射400个RH WT株和RHΔrop16株的速殖子（用200μl PBS稀释）。在感染孕鼠后第6天麻醉下处死小鼠。留取眼球血,取血清用ELISA的方法检测TNF-α和IL-12的表达情况。留取子宫和胎盘、胎鼠组织,观察胎鼠、胎盘出血吸收情况,称量胎鼠、胎盘重量并记录,比较正常组和感染RH WT组和RHΔrop16组胎鼠、胎盘重量变化情况。留取胎盘组织做组织病理学检查,HE染色,观察胎盘出血情况的变化。用流式细胞术检测脾细胞Th1（IFN-r）、/Th2（IL-4）细胞因子的变化情况。通过流式细胞术检测胎盘蜕膜巨噬细胞的M1（CD80、CD86）/M2（CD206）表型巨噬细胞分子的表达水平。免疫蛋白印迹法（WB）检测各组蜕膜组织中M1（iNOS）/M2（Arg-1）的蛋白表达水平。运用qPCR方法检测各组脾和胎盘组织中的M1（TNF-α、IL-12）/M2（TGF-β1）的表达。运用ELISA的方法检测脾和胎盘组织中M1的细胞因子TNF-α和IL-12的表达。结果:通过肉眼观察可以发现,与正常对照组对比,感染弓形虫后的孕鼠胎盘都出现了不同程度的出血和胎鼠吸收,胎鼠和胎盘重量明显下降,胎鼠胎盘的吸收率和流产率显著增加。与感染RH WT组比较,感染RHΔrop16组的胎盘出血、胎鼠吸收以及流产率更加严重。通过流式检测脾细胞的Th1的细胞因子表达IFN-?发现,与正常组对比,RH WT感染组和RHΔrop16感染组,IFN-?的表达均明显升高,其中RHΔrop16感染组的IFN-?的表达升高则更加明显。而Th2的细胞因子IL-4的表达在RH WT感染组和RHΔrop16感染组中下调,其中RHΔrop16感染组下调的则更加明显。通过流式检测蜕膜巨噬细胞的M1表型CD80、CD86和M2表型CD206发现,感染RH WT株和RHΔrop16株后CD80、CD86的表达均升高,而CD206的表达降低。其中RHΔrop16感染组的CD80、CD86的表达升高更明显,而其CD206降低也最明显。通过WB检测发现,与正常对照组对比,RHΔrop16感染组的iNOS的表达最高,RH WT感染次之,而RHΔrop16感染组Arginase-1的表达最低,RH WT感染组次之。感染弓形虫后,ELISA和qPCR检测结果发现,眼球血中,脾和胎盘组织中M1的细胞因子TNF-α、IL-12的表达明显升高。其中RHΔrop16感染组的M1的细胞因子升高最明显。而通过qPCR检测脾和胎盘组织中的TGF-β1发现,与正常对照组相比,感染组的TGF-β1的表达下调,其中RHΔrop16感染组的TGF-β1下调更为明显。结论:上述实验结果表明,弓形虫感染导致不良妊娠结局,不仅是由虫体大量增殖破坏引起,母胎界面免疫机能的紊乱也是导致不良妊娠结局的重要机制。其中通过RHΔrop16感染孕鼠导致了蜕膜巨噬细胞从正常妊娠时的M2向M1方向偏移,以及iNOS、IL-12和TNF-α的急剧升高;而Arginase-1、TGF-β1明显下调从而打破母胎免疫的微环境。以上表明,弓形虫基因型I型虫株的效应分子ROP16I/III可诱导M2巨噬细胞的偏移和Th2的优势应答,敲出ROP16 I/III的弓形虫可导致更加严重的不良妊娠结局。以上结果强烈提示,弓形虫ROP16 I/III不仅是基因型相关的毒力和宿主免疫调控的虫源性分子,其诱导的M2-Th2应答也可能是维持正常妊娠的保护性因素之一。