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背景与目的宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤。高危型人乳头瘤病毒(high risk human papilloma viruses,HR-HPV)的持续感染是目前较公认的宫颈癌发生及进展的确切诱因。HPV总共有两种类型,即高危型HPV(high risk HPV,HR-HPV)和低危型HPV(low risk,LR-HPV)。其中,HR-HPV持续感染与高级别宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CINII+)和浸润性宫颈癌(invasive cervical cancer)有关,低危型人乳头瘤病毒的感染与生殖器的疣以及CIN1等相关。由此见得,组织所感染的HPV类型直接决定了疾病的最终结局。然而,仅仅凭借高危型人乳头瘤病毒的感染远远不足以彻底地促进癌症的发生,这也提示我们,宫颈癌可能还存在着其他的致癌机制与HR-HPV感染一同引起宫颈的病变。研究表明,DNA的甲基化异常能够引起基因表达异常,促进癌症的发生。基因组水平的DNA甲基化是在DNMTs(DNA甲基化转移酶,DNA methyltransferases,简称DNMTs)的作用下,将胞嘧啶转化成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)的一种催化过程。目前已知的DNMT家族包括有DNMT1、DNMT 3a、DNMT 3b、DNMT3l和DNMT 2。DNMTs的改变(无论是表达水平还是功能的改变)对DNA甲基化模式的改变均起到一定程度的作用。有研究显示,DNMTs的表达水平在肝癌、卵巢癌、肺癌、子宫内膜癌等肿瘤细胞中均呈现升高趋势。也有的实验结果提示了DNMTs的改变和甲基化作用位点的紊乱是诱发宫颈癌的重要因素。如,宫颈癌组织及相应的癌组织中(细胞系水平)DNMTs表达与正常组织相比有明显差异。可见,DNA甲基化模式的改变也在某种程度上参与了宫颈癌的发生和发展。既然DNA甲基化和HR-HPV亚型的感染均是诱发宫颈癌发生发展的重要因素,那么它们之间是否存在着必然的联系。我们的研究团队在前期的研究中已证实:HPV16感染的细胞系(Caski细胞)和HPV18感染的细胞系(Hela细胞)中其OCT4(Octamer-bingding factor 4)的表达水平较没有病毒感染的细胞系(C-33A细胞)的表达水平升高;且dnmt3a的表达水平与oct4的表达呈负相关,可见dna甲基化水平可能与hpv高危亚型的感染存在密切联系。由于细胞经反复传代,可能其分子生物学行为已发生改变。因此,本文拟在临床标本上对宫颈癌、癌旁组织以及正常宫颈组织的dnmts的表达情况(rna水平和蛋白水平)进行分析,并分析其表达情况与hpv高危亚型感染之间的联系。材料与方法1.研究对象:选取宫颈癌组织及其对应癌旁组织标本40例为实验组,正常宫颈组织20例为对照组。宫颈癌组织及对应癌旁组织全部经病理检查证实(38例为鳞癌,2例为腺癌),正常宫颈组织为子宫肌瘤或子宫脱垂并行子宫全切者,所有标本均来自2012年12月-2014年6月第三军医大学大坪医院野战外科研究所妇产科住院患者。2.实验方法:(1)hpv分型检测:hpv分型检测由深圳华大临床检验中心完成。采用飞行时间质谱检测法对保存于特定dna保存液中的宫颈脱落细胞标本进行测定,测定亚型包括hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68,共14种高危亚型。(2)qpcr法检测宫颈癌组织、对应癌旁组织和正常宫颈组织的dnmts的mrna表达情况。(3)采用wb法及免疫组织化学法检测宫颈癌、对应癌旁组织以及正常宫颈组织的dnmts的蛋白表达情况。结果1.hpv高危分型检测结果60例组织标本中共有40例检出hpv高危亚型感染,其中癌组织占了95%(38/40),正常宫颈组织占了5%(2/40)。宫颈癌组织中hr-hpv感染为95.0%(38/40),而正常组感染率为10.0%(2/20),两组比较,有统计学差异(p<0.01)。在宫颈癌组中,hpv16,52,58,31,18的感染率最高;而两例正常宫颈组织的高危hpv检出亚型均为hpv16。所有hpv阳性的宫颈组织中,单一亚型感染占了57.5%(23/40);双重感染和多重感染占42.5%(17/40)。2.宫颈癌组织、对应的癌旁组织及正常的宫颈组织中dnmtsmrna表达情况宫颈癌组织及对应癌旁组织与正常宫颈组织相比,dnmt1、dnmt3a、dnmt3b、dnmt3l表达显著升高,dnmt2表达显著降低,p均<0.05。3.宫颈癌组织、癌旁组织及正常宫颈组织dnmts蛋白表达的情况免疫组化中,癌组织dnmt1表达率为90.0%(36/40),dnmt2表达率为12.5%(5/40),dnmt3a表达率为85.0%(34/40),dnmt3b表达率为70%(28/40),dnmt3l表达率为80.0%(32/40);癌旁组织中dnmt1表达率为87.5%(35/40),dnmt2表达率为17.5%(7/40),dnmt3a表达率为85.0%(34/40),dnmt3b表达率为72.5%(29/40),dnmt3l表达率为77.5%(31/40),正常宫颈组织中dnmt1表达率为25%(5/20),dnmt2表达率为85.0%(17/20),dnmt3a表达率为15.0%(3/20),dnmt3b表达率为20.0%(4/20),dnmt3l表达率为30.0%(6/20)。可见除dnmt2降低外,余dnmts在宫颈癌组织、对应癌旁组织中的表达率均显著高于正常宫颈组织(p<0.05)。5种蛋白均在细胞核内表达。westernblot中,癌组织中dnmt1表达率为90.0%(36/40),dnmt2表达率为15.0%(6/40),dnmt3a表达率为85.0%(34/40),dnmt3b表达率为70%(28/40),dnmt3l表达率为80.0%(32/40);癌旁组织中dnmt1表达率为87.5%(35/40),dnmt2表达率为10.0%(4/40),dnmt3a表达率为80.0%(32/40),dnmt3b表达率为75.0%(30/40),dnmt3l表达率为77.5%(31/40);正常宫颈组织中dnmt1表达率为20.0%(4/20),dnmt2表达率为90.0%(18/20),dnmt3a表达率为15.0%(3/20),dnmt3b表达率为20.0%(4/20),dnmt3l表达率为25.0%(5/20),与免疫组化结果相符。同样地,dnmt1、dnmt3a、dnmt3b、dnmt3l在宫颈癌组织、对应癌旁组织中的阳性表达率均显著地高于正常组(p<0.05),而dnmt2在宫颈癌组织、对应癌旁组织中的阳性表达率均显著地低于正常组(p<0.05)。4.dnmt的阳性表达情况与hr-hpv感染的相关性采用spearman等级相关分析方法,dnmt1、dnmt3a、dnmt3b的阳性表达与hr-hpv感染呈明显的正相关(r值分别为0.709、0.538和0.536,p均<0.05),dnmt2的阳性表达与hr-hpv感染呈明显的负相关(r=-0.438,p<0.05),而dnmt3l的阳性表达与高危亚型hpv感染无明显相关性(r=0.163,p>0.05)。结论1.宫颈癌组织中hr-hpv的感染率为95.0%,正常宫颈组织中hr-hpv的感染率为10.0%,提示hr-hpv的感染与宫颈癌的发生发展密切相关;2.5种dnmts在宫颈癌组织中的表达谱发生明显改变,癌组织及对应癌旁组织中,dnmt1、dnmt3a、dnmt3b、dnmt3l的表达显著高于正常宫颈组织,而dnmt2明显低于正常宫颈组织,提示这几种dna甲基转移酶可能参与了宫颈癌的发生发展过程;3.hpv高危亚型感染与宫颈癌组织中dnmt1、dnmt3a、dnmt3b的表达呈显著正相关,与DNMT2的表达呈明显负相关,而与DNMT3l的表达无明显相关性,提示可能存在某种或几种机制使得HR-HPV感染上调宫颈癌组织中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的表达、抑制DNMT2的表达,进而引起甲基化模式的改变,促进宫颈上皮的恶性病变。