石杉碱甲（Huperzine A,HupA）是从药用植物蛇足石杉（Huperzia serrata（Thunb.）Trev.）中提取出来的一种生物碱,是一种高效低毒的乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase,ACh E）靶向抑制剂,已被批准用于阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的临床治疗。蛇足石杉作为HupA的主要药源植物,因其HupA含量低、自然资源短缺且人工培育难度大,导致HupA供求矛盾日益突出。研究发现一些蛇足石杉内生真菌可以产HupA,这为解决HupA资源短缺提供了新思路。本研究通过对蛇足石杉进行内生真菌分离,以期获得HupA高产菌株;基于HupA产量高的内生真菌胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides,筛选出可能参与HupA合成的赖氨酸脱羧酶（LDC）和铜胺氧化酶（CAO）的基因序列,利用生物信息学方法分析候选基因;并进一步通过基因敲除实验验证候选基因功能,探究候选基因与HupA合成的关系,为解析HupA合成途径提供新依据。主要研究结果如下:（1）从蛇足石杉不同部位分离得到内生真菌共46株,按形态特征初步分为12种真菌。经LC-MS检测确认4号菌株具有产生HupA的能力。ITS序列分析鉴定,其属于镰刀菌属（Fusarium sp.）。通过HPLC测定4号菌株HupA产量为1.396μg/g（单位菌丝）,其产量显著低于课题组已分离的产HupA内生真菌C.gloeosporioides（5.036μg/g）。因此,后续研究将基于产量高的菌株C.gloeosporioides进行。（2）基于已测序的C.gloeosporioides基因组数据,筛选出2个LDC基因和12个CAO基因。与其余产HupA菌株的LDC和CAO家族基因同源比对后,筛选出LDC2151、LDC9857和CAO3097作为候选基因。生物信息学分析结果显示LDC2151与LDC9857编码蛋白的性质及空间结构相似性很高。推测LDC2151与LDC9857可能具有相同或相似的生物学功能。（3）构建了pUC-CAO3097敲除载体,转化获得CAO3097基因敲除突变菌株。对C.gloeosporioides野生型菌株和敲除菌株的菌丝生物量和次生代谢物HupA的产量进行测定,结果显示,突变菌株的菌丝生物量和HupA的单位产量均无显著变化。（4）基于CRISPR/Cas9技术原理,构建重组敲除载体p FC-LDC2151,并通过原生质体转化法转化内生真菌C.gloeosporioides,但未成功筛选到阳性转化子。综上,本研究分离鉴定到一株产HupA的内生真菌,筛选到3个可能参与HupA合成的基因,经分子生物学及生理学实验发现CAO3097缺失对内生真菌中HupA合成影响不显著,推测CAO基因家族中可能存在代偿基因代替CAO3097行使功能。本实验为C.gloeosporioides中HupA合成途径的研究及后续基因编辑体系的建立提供一定数据基础。