布鲁氏菌病（brucellosis，简称布病）是由布鲁氏菌引起的一种人兽共患病。该病广泛分布于世界各地，有170多个国家存在人畜布病。2000年以后，我国人畜布病的发病率呈逐年上升的趋势，给人类健康和畜牧业发展带来了巨大的危害。布鲁氏菌属中的牛、羊、猪、犬种布鲁氏菌不但可以感染家畜，而且均可以感染人类，是危害最为严重的种型。我国人畜布病中多种型感染的现象较为常见。牧区牛羊的养殖量大，人畜布病的疫情尤为严重。猪布病引起的感染现象不如牛羊布病疫情严重，不过猪布病引起人感染的报道也不少。我国犬的饲养量巨大，犬感染布鲁氏菌已得到证实。由于犬与人的接触密切，犬布病对人类构成了潜在威胁。目前，我国现有的布病病原学诊断方法均不能有效地区别牛、羊、猪、犬种布鲁氏菌。因此，研究一种能同时检测牛、羊、猪、犬种布鲁氏菌的多重PCR方法并组装出试剂盒，对于布病的流行病学调查和防控均具有重要的意义。本研究首先对牛、羊、猪、犬种布鲁氏菌的基因序列进行了生物信息学分析，根据牛、羊种布鲁氏菌在ABC转运结合蛋白（BR0951-BR0955）上缺失2653个碱基，犬种布鲁氏菌在wbkF-wbkD区域缺失351个碱基，以及牛、羊种布鲁氏菌IS711拷贝数和位置的差异，设计了四对引物，根据PCR扩增目的片段的大小，鉴别牛、羊、猪、犬种布鲁氏菌的种型。对退火温度、延伸时间、引物浓度等PCR反应条件进行了优化，确定最佳的多重PCR反应，并对优化后的多重PCR反应进行特异性、灵敏度、重复性分析。最后，通过制备牛羊猪犬种布鲁氏菌的阳性质控品、阴性质控品、PCR引物、PCR反应液等组分，组装了牛羊猪犬种布鲁氏菌多重PCR检测试剂盒，从特异性、灵敏度、重复性、保存期等方面对试剂盒的性能进行了评价。初步应用该试剂盒检测模拟的奶样、小鼠的脾脏、牦牛和羊流产胎儿脾脏菌液样本，进一步验证试剂盒对样本检测的实用性。本研究利用单对引物PCR反应初步验证所设计的4对引物是正确的，可以用于多重PCR反应。通过对引物浓度、退火温度、退火时间、延伸时间、循环参数的优化，建立了最佳的多重PCR反应，并从特异性、灵敏度、重复性三方面对多重PCR方法进行了评价。结果表明，该方法的特异性强，与小肠耶尔森氏菌O:9、大肠杆菌O157:H7等与布鲁氏菌亲缘关系较近的细菌反应皆为阴性；灵敏度高，检测牛、羊、猪、犬种布鲁氏菌的灵敏度分别为1.1×102CFU/mL、5.1×102CFU/mL、2.5×102CFU/mL、3.5×102CFU/mL，灵敏度都达到102CFU/mL以上。重复验证多重PCR反应，结果一致，表明该多重PCR方法的重复性好。根据建立的多重PCR检测方法，制备了阳性质控品、阴性质控品，PCR引物、PCR反应液等组分，组装了牛羊猪犬种布鲁氏菌多重PCR检测试剂盒。试剂盒的特异性强，与小肠耶尔森氏菌O:9、大肠杆菌O157:H7等与布鲁氏菌亲缘关系较近的细菌反应皆为阴性；灵敏度高，检测牛、羊、猪、犬种布鲁氏菌的灵敏度都达到102CFU/mL以上；重复性好，在试剂盒的批次内和批次间检测结果无差异。试剂盒存储在-20℃下，保存期为8个月。试剂盒检测牛、羊、猪种布鲁氏菌模拟奶样的灵敏度达到1.0×103CFU/mL，检测犬种布鲁氏菌模拟奶样的灵敏度达到1.0×104CFU/mL，并能够准确检测出小鼠脾脏感染的布鲁氏菌种型。用本研究组装的试剂盒和我国出入境检验检疫行业标准中规定的布鲁氏菌PCR方法同时检测牦牛和羊流产胎儿脾脏菌液样本，行业标准中的布鲁氏菌PCR方法只能鉴定到布鲁氏菌属的水平，无法区分种型。本研究组装的试剂盒能够进一步对布鲁氏菌属分型，鉴定到种的水平，而且准确率高，快速简便，具有良好的应用价值。上述研究结果表明本研究建立的能同时检测牛、羊、猪、犬种布鲁氏菌多重PCR方法，具有良好的特异性和灵敏度。组装的试剂盒通过对模拟样本和临床样本的检测，其实用性得到了进一步验证。