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纤维素是地球上最廉价而且最丰富的可再生资源,如果利用其作为生产燃料乙醇的原料将是解决世界能源紧缺的有效途径,但是目前还没有有效方法对其进行充分利用。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有很高的糖醇转化率,是理想的乙醇生产菌株,但其缺乏有效降解纤维素的酶,不能直接降解纤维素发酵产乙醇。 本研究将里氏木霉(Trichoderma reesei)内切葡聚糖酶Ⅰ(endo-1,4-β-D-g ulcanaseⅠ,eg1)和黑曲霉(Aspergillus niger)β-葡萄糖苷酶Ⅰ(β-glucosidaseⅠ,bgl1)的编码基因同时整合到酿酒酵母基因组中,构建具有降解非结晶纤维发酵产乙醇的重组酿酒酵母。在此基础上,初步研究了重组表达的里氏木霉膨胀素活性,以及膨胀素对纤维素酶降解纤维素的促进作用。 本研究提取里氏木霉的RNA,通过RT-PCR扩增获得里氏木霉内切葡聚糖酶Ⅰ基因(eg1),然后与黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因(bgl1)一起克隆到表达载体pδRCMB上,构建的重组表达载体pδRCMB-bgl1-eg1电转化酿酒酵母细胞,二者以δDNA序列整合的方式整合到酿酒酵母W303-1A基因组中。经G418抗性筛选、菌落PCR和刚果红平板染色筛选获得成功整合eg1和bgl1的重组酿酒酵母S.cerevisiae-eb。对培养液上清中表达的EGⅠ和BGLⅠ酶活进行分析,运用SDS-PAGE电泳和酶活性染色分析了重组蛋白的表达。以PASC为唯一碳源,进行了重组酿酒酵母S.cerevisiae-eb直接发酵PASC产乙醇的研究。 重组酵母S.cerevisiae-eb表达的EGⅠ酶活在120 h达到最高值0.10 IU/mL,最适温度为60℃,最适pH为6.0。BGLⅠ酶活在144 h达到最高值4.83 IU/mL,最适pH为4.5,最适温度为60℃。Fe3+和Co2+对EGⅠ和BGLⅠ的酶活性都有抑制作用,而Ca2+和Zn2+显著增强两种酶的活性,Mn2+和Mg2+能显著提高BGLⅠ的酶活,但抑制EGⅠ的酶活。 经SDS-PAGE电泳和酶活性染色分析发现,EGⅠ在110-160 kDa分子量范围内出现三条活性条带,BGLⅠ在约140 kDa处出现活性条带,均大于预期分子量。重组蛋白经过去糖基化处理后,分别在约50 kDa和100 kDa出现表达条带,接近两种蛋白的预期分子量,证明重组酵母表达的EGⅠ和BGLⅠ都发生了糖基化修饰。重组酵母S.cerevisiae-eb能以5 g/L的PASC为唯一碳源进行生长和发酵,发酵开始后60 h达到生成乙醇的最高值1.2 g/L。乙醇产量达到理论值的42.78％。 本研究将里氏木霉膨胀素基因(swol)整合到酿酒酵母基因组中进行分泌表达。重组表达的膨胀素蛋白能够膨化滤纸,增大滤纸的透光性。用共培养的方法将重组酿酒酵母S.cerevisiae-eb和S.cerevisiae-swol共同降解微晶纤维素发现,膨胀素能够促进EGⅠ和BGLⅠ两个纤维素酶对纤维素的降解,对纤维素的降解起到一定的辅助作用。 综上所述,本研究成功构建了能共表达EGⅠ和BGLⅠ的重组酿酒酵母S.cerevisiae-eb,并能在PASC为唯一碳源的培养基中生长,发酵生产乙醇。构建了能分泌表达膨胀素的重组酿酒酵母S.cerevisiae-swol可以有效的膨化纤维素,对纤维素的降解起到辅助作用。本研究为探索将纤维素物质直接转化为乙醇提供了有益的探索。