论文部分内容阅读
本文运用尿素法和SDS法自坛紫菜丝状体和叶状体提取DNA，用CTAB/NaCl溶液去除剩余的多糖，反复多次，能纯化得到高质量的DNA，经紫外分光光度计检测，OD260/OD280值为1.84～1.93之间，琼脂糖凝胶电泳可知大小为23kb左右，可用于坛紫菜DNA质粒文库的构建、酶切反应和SSR-PCR扩增。
用限制性内切酶Sau3AI处理提取的丝状体DNA后，选择性回收300～900bp的片段，然后将这些小片段DNA连接至经BamHI酶切并经细菌碱性磷酸酶(BAP)去磷酸化处理后的pUC18质粒载体上，最后转化至大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109感受态细胞中，从而构建了坛紫菜部分小片段DNA质粒文库。经蓝/白斑筛选，获得384个白色克隆；选用pUC18质粒的通用引物(5-GTAAAACGACGGCCAGT-3，5-CAGGAAACAGCTATGAC-3)进行PCR反应来对这些阳性克隆进一步筛选并检测插入片段的大小，其中278个含有大小合适的插入片段。将含有300～900bp之间插入片段的克隆送交测序，并利用网络在线软件进行序列分析，在坛紫菜中获得172个微卫星序列，分别分布于103个不同的阳性克隆中。
在发现的微卫星序列中选取了32条微卫星序列设计了引物，然后进行SSR-PCR扩增。SSR-PCR优化反应体系为：0.4μM引物，200μMdNTPs，1.5mMMg2+，1UTaqDNA聚合酶，30ng左右模板DNA；优化反应程序：94℃预变性5min后进入循环体系，94℃变性30s，50～54℃退火30s，72℃延伸1min，进行40个循环；72℃延伸7min。在9对能够扩增出产物中，其中有7对适合进行微卫星分析。