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研究背景与目的结肠癌是发生于结肠部位的常见的消化道恶性肿瘤,以40岁～50岁年龄组发病率最高,男女之比为2~3:1。欧美地区发病率居内脏种瘤前二位,在我国的发病率与死亡率仅低于胃癌,食管癌、肺癌等常见恶性肿瘤,其根治性切除后5年生存率仅为50%左右,术后复发和转移是其死亡的重要原因。随着人民生活水平的提高,饮食结构的改变,其发病率呈逐年上升趋势,因此早期发现、早期诊断、早期治疗对阻止癌变的发生发展相当重要。S100蛋白家族是一组具有EF-手形的钙调蛋白,包含至少25个成员,具有一系列生理功能,如参与细胞增殖、细胞外信号转导、细胞间黏附、细胞动力、钙稳态、蛋白质磷酸化、酶活性和转录因子的调节等;S100蛋白家族中21个成员定位于人染色体lq21,该区段染色体稳定性差,易发生染色体重排,S100A2基因也定位于此。现已发现S100蛋白家族的多个成员(S100A2、A4、A6、A7、A8、A9、A12和B等)在肿瘤中表达异常,并与肿瘤的浸润、转移和病人的预后有关。环氧化酶( cyclooxygenase, COX) ,又名前列腺素过氧化物合成酶,是花生四烯酸代谢的关键性限速酶。在各种细胞因子、炎性递质以及促癌剂等刺激因素作用下, COX-2表达明显上调,参与机体的多种生理及病理过程,还与多种肿瘤的发生、发展和转移有关。Wnt/β-catenin信号通路是在正常发育及病理过程中发挥重要作用的通路,也是目前公认与肿瘤密切相关的信号通路之一。β-catenin是该信号途径的关键分子,在多种肿瘤中均可见β-catenin的高表达。本课题拟研究人S100A2(hS100A2)对人结肠癌细胞系HCT116和SW480细胞增殖、凋亡、周期、迁移、侵袭能力及裸鼠皮下成瘤的影响,并探讨hS100A2对细胞及瘤体组织中COX-2和β-catenin的影响,为阐明hS100A2在结肠癌发生发展中的作用提供实验依据。方法1.重组蛋白GST-hS100A2的制备和鉴定:氯化钙法将pGST-moluc和pGST-moluc-hS100A2质粒转入宿主大肠杆菌BL21,异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,冰上超声裂解细菌后,用谷胱甘肽-琼脂糖4B球珠(Glutathione Sepharose 4B beads)分离纯化GST和GST-hS100A2,经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis , SDS-PAGE )和Quantity One软件鉴定和分析纯化效果,Western-blot法鉴定重组蛋白,BCA法进行蛋白定量,0.22μm滤膜过滤后分装于-80℃保存备用。2.用不同浓度的GST-hS100A2作用HCT116和SW480细胞,MTT法检测hS100A2对细胞增殖的浓度依赖性。3.依据以上实验选择合适的蛋白浓度作用细胞后,分别用MTT法检测细胞增殖、Hoechst33258染色检测细胞凋亡、流式细胞术检测细胞周期、划痕愈合法检测细胞迁移能力及Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化。4.扩增和鉴定人S100A2重组腺病毒(AdhS100A2),以适当感染效率感染HCT116细胞,收集细胞接种裸鼠,观察hS100A2对HCT116细胞的皮下移植瘤生长的影响。5.分别用RT-PCR、Western blot、免疫细胞化学法检测hS100A2对HCT116细胞内COX-2和β-catenin水平的影响;免疫组织化学法检测hS100A2对裸鼠皮下瘤块组织中COX-2和β-catenin表达的影响。结果1.HindⅢ和EcoRI双酶切pGST-moluc-hS100A2质粒后,可见300bp左右目的片段,与其限制性内切酶谱相符。SDS-PAGE分析所获得的重组蛋白GST-S100A2纯度达92%,Western blot显示该蛋白可被S100A2抗体特异性识别,在36KD处出现特异性条带。BCA法测定1 L菌液共收获约15.7 mg蛋白。2.在所检测的浓度范围内(3μg/ml到300μg/ml),外源性hS100A2以剂量依赖方式降低HCT116细胞和SW480细胞的存活率(P<0.05);依此选择100μg/ml为后续实验的干预浓度;在此浓度下,hS100A2以时间依赖方式降低HCT116细胞和SW480细胞的存活率(P< 0.05)。3.Hoechst33258染色显示:hS100A2处理48h的HCT116和SW480细胞的凋亡率分别是对照组的3.7倍和4.2倍(P<0.05),提示hS100A2能够促进细胞凋亡。4.流式细胞术结果显示:hS100A2处理HCT116细胞12h时G0/G1期细胞比对照组增加49.3%( P<0.05),G2/M期细胞减少41.6%(P<0.05),提示hS100A2可使细胞发生G0/G1阻滞。5.划痕愈合实验发现hS100A2处理的HCT116细胞迁移能力降低:其12h和24h的划痕愈合率分别比对照组降低40.7%和19.2% (P<0.05)。6.Transwell侵袭实验发现hS100A2降低两种细胞的侵袭能力:24h穿过小室膜的HCT116和SW480细胞数分别较对照组减少73%(P<0.05)和65% (P<0.05)。7.裸鼠皮下成瘤实验显示:hS100A2在体内能抑制皮下移植瘤的生长,延缓其发展进程。AdhS100A2感染的HCT116细胞接种裸鼠6天后皮下成瘤,各组成瘤率相同,均为80%;但AdhS100A2组瘤块生长缓慢,26天处死时其瘤块体积为对照组的10.4% (P<0.05);各组裸鼠解剖后体内均未发现转移灶。8.RT-PCR显示外源性hS100A2可使HCT116细胞内COX-2的mRNA降低78.4% (P<0.05);Western blot显示外源性hS100A2可降低细胞内COX-2和β-catenin蛋白水平,其中,hS100A2组COX-2的校正灰度值比相应对照组减少70%(P<0.05),β-catenin的校正灰度值比相应对照组减少25% (P<0.05);免疫细胞化学也显示hS100A2可降低细胞内COX-2和β-catenin水平,与Western blot结果一致;免疫组织化学法检测显示hS100A2可降低裸鼠皮下瘤体组织中COX-2和β-catenin水平,其中AdhS100A2组COX-2的平均光密度比相应对照组减少78.7% (P<0.05),β-catenin的平均光密度比相应对照组减少34.9% (P<0.05)。体内与体外实验的结果一致。结论1.经原核诱导表达出高纯度有生物学活性的GST-hS100A2。2.外源性hS100A2对人结肠癌细胞系HCT116和SW480细胞具有抑制性作用,包括抑制增殖、促进凋亡、G0/G1期阻滞、抑制细胞迁移和侵袭;体内实验也证实其对裸鼠皮下移植瘤的生长具有抑制作用,可延缓其发展进程。3.外源性hS100A2可减少HCT116细胞内COX-2基因的转录,可降低HCT116细胞内及其皮下移植瘤组织中COX-2和β-catenin蛋白水平。提示hS100A2可能通过抑制COX-2和Wnt/β-catenin信号来发挥其对结肠癌的抑制作用。