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卵泡发育是非常复杂的生理过程,除了需要大量的基础营养物质外,还需要激素、生长因子、脂肪酸等多种物质。花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)是多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFAs)的一种,在卵泡液中,AA约占到卵泡液总脂肪酸的2.5%,但是,AA在卵泡发育过程中的作用还未被深入研究。本研究通过向体外培养的牛卵巢颗粒细胞中添加不同浓度的AA(0.1%DMSO、1、10、50、100、200μM),旨在探讨AA对卵巢颗粒细胞生理功能的影响,拟阐明AA在牛卵巢颗粒细胞中的分子机制,为提高卵泡及卵母细胞发育潜能提供数据支持与理论指导。试验一花生四烯酸对牛卵巢颗粒细胞体外存活的影响添加不同浓度的AA处理体外培养的牛卵巢颗粒细胞,利用CCK-8试剂盒检测细胞活力。研究结果表明,50 AA处理24 h能够显著提高牛卵巢颗粒细胞活力。同时,本试验还对AA处理后的颗粒细胞的细胞核形态、细胞凋亡比例和凋亡相关基因的表达结果进行研究。结果表明,与对照组相比,50μM AA处理组荧光强度弱,较少细胞细胞核表现凋亡形态学改变;流式细胞仪检测结果显示,50μM AA处理后的颗粒细胞凋亡率(18.26±1.57%)显著低于对照组(24.51±1.80%),而200μM AA处理后的颗粒细胞凋亡率(90.22±3.11%)显著高于对照组;同时,50μM AA促进BCL-2的表达,抑制BAX的表达(P<0.05)。试验二花生四烯酸对卵巢颗粒细胞脂滴形成的影响添加不同浓度的AA处理牛卵巢颗粒细胞,24 h后,用油红O染色检测细胞内脂滴积累情况,实时定量PCR检测颗粒细胞中脂肪酸转运相关基因的表达水平。结果表明,AA能够诱导卵巢颗粒细胞脂滴的形成;在1、10μM AA处理组的颗粒细胞内可观察到小脂滴;50、100μM AA处理组的颗粒细胞,脂滴体积增大,数量增多,但是200μM AA处理后的颗粒细胞,脂滴数量稀少,体积缩小且分布不均一;0~100μM的AA处理后,FABP3和CD36的表达水平呈剂量依赖性升高;50μM AA上调SLC27A1的基因表达水平,200μM AA下调CD36的表达(P<0.05)。试验三花生四烯酸对牛卵巢颗粒细胞作用机制研究为了研究AA对牛卵巢颗粒细胞的影响机制,本试验利用AA处理体外培养的颗粒细胞,24 h后收集细胞培养液,放射免疫法(RIA)测定细胞培养液中类固醇激素含量,实时定量PCR检测类固醇激素合成相关基因表达,Western Blot检测细胞中AKT及ERK 1/2蛋白的磷酸化水平。研究结果表明,与对照组相比,高浓度(100,200μM)的AA抑制颗粒细胞合成雌激素(P<0.05),而低浓度AA不影响雌激素的合成量;另外,AA可以促进颗粒细胞合成孕酮且呈剂量依赖性效应;在类固醇激素合成酶基因表达方面,50、100和200μM AA降低CYP19A1,FSHR和HSD3B1的表达(P<0.05),AA降低STAR的表达;50μM AA处理颗粒细胞显著增加AKT和ERKI/2的磷酸化水平。根据以上研究结果可知:(1)50μM的AA通过激活MAPK及PI3K/Akt通路促进牛卵巢颗粒细胞增殖,而高浓度(200μM)AA诱导细胞凋亡;(2)50、100μM的AA促进牛卵巢颗粒细胞脂滴累积,诱导细胞形态改变;(3)AA可能调控颗粒细胞合成类固醇激素,高浓度的AA(100、200μM)显著抑制颗粒细胞合成雌激素,AA促进孕酮合成,且呈剂量依赖效应。