研究目的:血管并发症是糖尿病患者主要的死亡原因,其中包括大血管并发症和微血管并发症。在糖尿病血管并发症中,血管内皮细胞是高血糖首先破坏的靶点,高血糖导致血管内皮细胞损伤与凋亡,内皮细胞功能失调,血管内皮完整性和血管功能遭到破坏。因此防止血管内皮细胞损伤和凋亡对预防糖尿病血管并发症具有重要意义。目前为止,高血糖导致血管内皮细胞损伤已经被证实,但是作用机制尚不完全明了。PGC-1α是过氧化物酶体增值活化受体γ辅助活化因子1 (PGC-1)的成员之一,在能量代谢和线粒体功能中,PGC-1 α是一个关键的调节因子。越来越多的证据表明,PGC-1 α的表达与糖代谢紧密相关。有学者发现,胰岛素抵抗者的脂肪组织中、2型糖尿病患者的骨骼肌内的PGC-1 α表达明显降低;在糖尿病模型的肝脏组织中,PGC-1 α在肝糖异生过程中具有关键调节作用。亦有证据表明,PGC-1 α是线粒体功能和活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)代谢的有力的调节因素,而线粒体结构和功能的变化是细胞凋亡的枢纽环节,过量的ROS能引发内源性细胞凋亡途径。有研究显示,提高PGC-1 α水平可以通过活性氧簇净化酶途径来减少神经细胞内氧化应激导致的细胞凋亡。近期研究表明,减少PGC-1α的表达影响血管平滑肌细胞的增殖和迁徙。因此我们推测,PGC-1α可能是糖尿病血管并发症中血管内皮细胞损伤和凋亡的重要病理生理因素,PGC-1 α在血管内皮细胞中的作用以及其是否参与高糖环境下血管内皮细胞的损伤与凋亡以及可能的作用机制目前国内外研究较少。本研究旨在利用携带有PGC-1 α的小片段干扰核糖核酸的腺病毒(adenovirus encoding a small hairpin RNAof PGC-1α, Ad-shPGC-1α)降调节 PGC-1 α 的表达,探讨 PGC-1 α 与高糖环境诱导下人脐静脉血管内皮细胞损伤与凋亡的关系并就其可能作用机制做系列深入研究,以期更好的了解糖尿病血管病变的发病机制,为早期预防糖尿病血管病变提供理论依据。研究方法:1.细胞培养与处理:在无菌条件下,取通过剖宫产手术出生,健康产妇的足月新生儿的脐带,收集脐带内人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)并在适宜条件下培养传代,取3-8代的细胞进行后续实验。为建立恰当的糖尿病体外实验条件,我们首先将培养的脐静脉血管内皮细胞分为基础条件细胞组(对照组)(M199加全培养基含5. 5mmol/L葡萄糖、20%FBS、2% L-谷氨酰胺、100U/ml青链霉素双抗)、甘露醇组(甘露醇25mmol/L)、11 mmol/L葡萄糖处理组,15 mmol/L葡萄糖处理组及25 mmol/L葡萄糖处理组共五组细胞,分别孵育48小时;再选择最佳葡萄糖浓度下孵育细胞12、24、48、72、96小时。用CCK-8试剂盒检测细胞增殖,蛋白免疫印迹(Western Blot)检测PGC-1α蛋白表达。2.探究下调PGC-1 α对人脐静脉内皮细胞增殖及凋亡的影响。(1)用携带PGC-1α的小片段干扰核糖核酸的腺病毒(Ad-shPGC-1 α )转染脐静脉血管内皮细胞,从而下调PGC-1α,用携带无效片段的PGC-1α小片段干扰核糖核酸的腺病毒(control shRNA,Ad-Scr)转染脐静脉血管内皮细胞作为对照,转染条件为感染复数(multiplicity of infection, MOI)分别为 10、20、40,转染 24 小时。转染后分别用 Western Blot 及实时定量 PCR (Quantitative Real-time PCR,qPCR)检测PGC-1 α蛋白表达及mRNA水平。(2) Ad-shPGC-1 α及Ad-Scr分别转染基础条件细胞组及高糖诱导组细胞,用CCK-8法检测各组实验细胞增殖(实验分组:对照组、高糖诱导组、Ad-Scr转染基础条件细胞组及转染高糖诱导组、Ad-shPGC-1 α转染基础条件细胞组及转染高糖诱导组);用流式细胞仪检测各组细胞凋亡,使用的试剂盒为FITC-Annexin V/PI双染细胞凋亡检测试剂盒。3.探明下调PGC-1 α对线粒体内膜通透性及膜电位的影响。(1)用钙黄绿色染色法(Calcein-AM)检测线粒体内膜通透性:将Calcein-AM探针和CoCl2与实验细胞置于37℃细胞培养箱内孵育10min,激光扫描共聚焦显微镜下观察实验细胞,并用全自动定量绘图酶标仪分析荧光密度;(2)用JC-1染色法检测线粒体膜电位:将实验细胞与JC-1染料于37℃环境内孵育15min。用激光扫描共聚焦显微镜观察实验细胞,并用ImageJ软件分析其荧光强度。线粒体膜去极化的程度用红光与绿光的比值来衡量。(实验分组:对照组、高糖诱导组、转染Ad-shPGC-1 α高糖诱导组、转染Ad-Scr高糖诱导组)4.进一步探明下调PGC-1 α对线粒体膜通透性的影响。我们检测高糖诱导的内皮细胞细胞色素C(Cytochromec,Cytc)释放和半胱氨酸蛋白水解酶(Caspase )活性的改变。用Western Blot分别检测了细胞线粒体及细胞质内的Cyt c蛋白表达,细胞质Caspase-3及Caspase-9的蛋白表达(实验分组:同3)。5.因为细胞凋亡与抗细胞凋亡蛋白Bcl-2及促细胞凋亡蛋白Bax,活性氧簇(ROS),内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)关系密切,为探明PGC-1 α在高糖诱导的血管内皮细胞凋亡过程中是否与它们相关。我们设计:(1)用Western Blot分别检测各组实验细胞内的Bcl-2/Bax的蛋白表达。(2)采用 H2DCF-DA (2’,7’-Dichlorofluorescin diacetate)荧光探针法检测 ROS,各组实验细胞内的荧光密度采用全自动定量绘图酶标仪来分析,细胞内ROS的水平则通过各组实验细胞内所检测到的荧光强度来反映。(3) GRP78蛋白为内质网应激的标志蛋白,通过Western Blot检测各组细胞内的GRP78蛋白表达(实验分组:同3)。6.因为电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC)在细胞凋亡中有重要作用,为了解PGC-1 α在高糖诱导的血管内皮细胞凋亡过程中是否与其相关,我们先用Western Blot检测了各组实验细胞内的VDAC1-3三种电压依赖性阴离子通道蛋白的表达;选择VDAC抑制剂,抑制实验细胞内VDAC的活性,并用流式细胞仪检测各组实验细胞凋亡情况。(实验分组:对照组,基础条件细胞+抑制剂组,转染Ad-shPGC-1 α高糖诱导组,转染Ad-shPGC-1 α高糖诱导细胞+抑制剂组)研究结果:1.在不同葡糖糖浓度下孵育48小时后的实验细胞,甘露醇组与对照组细胞增殖相同,无显著性差异(P>0. 05)。不同高糖浓度处理下的各组细胞增殖均有降低,与对照组比较均有显著性差异(P<0.01),在15mmol/L葡萄糖处理组降低最明显;实验细胞在15mmol/L葡萄糖浓度下孵育12, 24,48, 72和96小时后,在24, 48, 72和96小时组细胞增殖均有降低,与对照组比较有显著性差异(P<0. 01),在孵育48小时组细胞增殖降低最明显。同时用Western Blot检测各组PGC-1 α蛋白表达,发现PGC-1 α蛋白表达水平与高糖诱导的脐静脉内皮细胞增殖降低相关,在不同糖浓度组和不同时间组PGC-1 α蛋白表达均有降低,与对照组比较有显著性差异(P<0. 01),在15mmol/L葡萄糖处理组及孵育48小时组PGC-1α蛋白表达降低最明显。因此,在后面的实验条件中,高糖诱导细胞组实验条件设定为糖浓度15 mmol/L,孵育时间48h。2.下调PGC-1 α对人脐静脉内皮细胞增殖及凋亡的影响。(1)脐静脉血管内皮细胞被Ad-shPGC-1α转染,结果显示,不同感染复数(MOI)的各组实验细胞,PGC-1 α蛋白表达及mRNA水平均有降低,与对照组比较均有显著性差异(P<0. 01),在感染复数为20条件下,PGC-1 α蛋白表达及mRNA水平降低最明显;同时用Ad-Scr转染的脐静脉血管内皮细胞,未发现PGC-1 α的蛋白表达及mRNA水平改变,与对照组比较无显著性差异(P>0. 05)。(2)用CCK-8法检测脐静脉血管内皮细胞增殖,实验结果显示在未经高糖诱导的血管内皮细胞中,转染Ad-shPGC-1α或Ad-Scr后,均未见细胞增殖的下降,与对照组比较无显著性差异(P>0. 05);而高糖诱导细胞组,细胞增殖明显降低,与对照组比较有显著性差异(P<0. 01);转染Ad-shPGC-1α的高糖诱导组,细胞增殖进一步降低,与高糖诱导组比较有显著性差异(P<0. 01);转染Ad-Scr的高糖诱导组,细胞增殖明显降低,与对照组比较有显著性差异(P<0. 01),与高糖诱导组比较细胞增殖无变化(P>0. 05)。(3)流式细胞仪检测细胞凋亡:在未经高糖诱导的血管内皮细胞中,转染Ad-shPGC-1 α或Ad-Scr后,细胞凋亡率无明显变化,与对照组比较无显著性差异(P>0. 05);经高糖诱导的血管内皮细胞组,细胞凋亡率明显增加,与对照组比较有显著性差异(P<0. 01);转染Ad-shPGC-1α的高糖诱导组细胞,细胞凋亡率进一步增加,与高糖诱导组比较有显著性差异(P<0. 01);转染Ad-Scr的高糖诱导组细胞,细胞凋亡率明显增加,与对照组比较有显著性差异(P<0. 01),与高糖诱导组比较细胞凋亡率无变化(P>0. 05)。3下调PGC-1 α对线粒体膜通透性及膜电位的影响。(1)我们首先用钙黄绿色染色法(Calcein-AM)检测线粒体膜通透性。实验结果发现:单独高糖诱导组的脐静脉内皮细胞,线粒体膜损伤,通透性增加,与Calcein-AM探针及CoC12共同孵育后,膜内绿色荧光被膜外的CoC12淬灭,膜内绿色荧光减少,荧光密度下降,与对照组比较有显著性差异(P<0. 01);转染Ad-shPGC-1α高糖诱导细胞组线粒体膜损伤加重,膜内绿色荧光进一步减少,荧光密度进一步降低,与高糖诱导组比较有显著性差异(P<0. 01);而在转染Ad-Scr高糖诱导组,膜内绿色荧光减少,荧光密度下降,与对照组比较有显著性差异(P<0.01),与高糖诱导组比较无明显变化(P>0.05)。(2)用JC-1染色法检测线粒体膜电位。用JC-1线粒体荧光探针孵育实验细胞,实验结果发现,高糖诱导组线粒体基质内红色荧光降低,同时绿色荧光增加,红绿荧光的比值降低,与对照组比较有显著性差异(P<0.01) ;转染Ad-shPGC-1α高糖诱导组,红色荧光进一步减少,绿色荧光增加,红绿荧光比值进一步降低,与高糖诱导组比较有显著性差异(P<0. 01);转染Ad-Scr高糖诱导组,红绿荧光比值降低,与对照组比较有显著性差异(P<0. 01),与高糖诱导组比较无明显变化(P>0.05)。4.进一步探明下调PGC-1 α对线粒体膜通透性的影响,我们检测高糖诱导的脐静脉内皮细胞细胞色素c释放和半胱氨酸蛋白水解酶Caspase活性的改变。Western Blot结果显示,在高糖诱导细胞组,细胞质内的细胞色素c蛋白表达增加,与此同时,线粒体内的细胞色素c明显减少,细胞质与线粒体细胞色素c蛋白表达比值升高,与对照组比较均有显著性差异(P<0. 01);转染Ad-shPGC-1α高糖诱导组,细胞质内细胞色素c蛋白表达进一步增加,线粒体内细胞色素c蛋白表达进一步减少,细胞质与线粒体细胞色素c蛋白表达比值进一步升高,与高糖诱导组比较均有显著性差异(P<0. 01)。在高糖诱导组细胞Caspase-3及Caspase-9蛋白表达都明显增加,与对照组比较有显著性差异(P<0.01);转染Ad-shPGC-1 α的高糖诱导组,Caspase-3及Caspase-9蛋白表达增加更加明显,与高糖诱导组比较有显著性差异(P<0. 01)。在转染Ad-Scr高糖诱导组,细胞色素c及Caspase蛋白表达情况,与对照组比较有显著性差异(P<0. 01),与高糖诱导组比较无明显变化(P>0. 05)。5.探明PGC-1 a在高糖诱导的脐静脉血管内皮细胞凋亡过程中,与抗细胞凋亡蛋白Bcl-2及促细胞凋亡蛋白Bax,活性氧簇(ROS),内质网应激(ERS)的关系。(1)我们首先通过实验观察Bcl-2与Bax蛋白表达。实验中Western Blot结果显示,高糖诱导组抗细胞凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达减少,同时促细胞凋亡蛋白Bax蛋白表达增加,与对照组比较均有显著性差异(P<0.01);在转染Ad-Scr及转染Ad-shPGC-1 α高糖诱导组,Bcl-2蛋白表达减少,同时Bax蛋白表达增加,与对照组比较均有显著性差异(P<0. 01),与高糖诱导组比较均无明显变(P>0.05)。(2)实验观察细胞内的活性氧簇(ROS)。实验结果发现,高糖诱导的脐静脉血管内皮细胞组,ROS产生明显增加,荧光密度增加,与对照组比较有显著性差异(P<0.01);在转染Ad-shPGC-1α的高糖诱导组及转染Ad-Scr的高糖诱导组,ROS的产生亦明显增加,荧光密度增加,与对照组比较均有显著性差异(P<0. 01),但与高糖诱导组比较均无明显变化(P>0. 05)。(3)实验观察内质网应激标志蛋白GRP78蛋白表达。实验中Western Blot结果显示,在高糖诱导组细胞GRP78蛋白表达增加,与对照组比较有显著性差异(P<0.01);在转染Ad-Scr高糖诱导组,GRP78蛋白表达增加,与对照组比较有显著性差异(P<0. 01),与高糖诱导组比较无变化(P>0. 05);但在转染Ad-shPGC-1α的高糖诱导组,GRP78蛋白表达明显减少,与高糖诱导组比较有显著性差异(P<0.01) 。6. 了解PGC-1 α在高糖诱导的脐静脉血管内皮细胞凋亡过程中与电压依赖性阴离子通道(VDAC)关系。我们首先检测了电压依赖性阴离子通道三种亚型(VDAC1-3)在各组实验细胞内的蛋白表达,与对照组比较,在高糖诱导组三种通道蛋白亚型表达均有所增加;但在转染Ad-shPGC-1α的高糖诱导组,与单独高糖诱导组比较,只有VDAC1蛋白表达进一步增加,VDAC2-3蛋白表达无明显变化。因此我们推测,在下调PGC-1α增加高糖诱导的脐静脉血管内皮细胞凋亡的机制中,VDAC1可能是一个关键性因素。为进一步证实,我们在转染Ad-shPGC-1α的高糖诱导组,加入 VDAC1 的抑制物 DIDS(4,4’ -diisothiocya-nostilbene-2, 2’-disulfonic acid )。经流式细胞仪检测细胞凋亡显示,在基础条件细胞加DIDS组,细胞凋亡率无明显变化,与对照组比较无显著性差异(P>0. 05);在转染Ad-shPGC-1 α高糖诱导组,细胞凋亡明显增加,在转染Ad-shPGC-1 α的高糖诱导细胞加DIDS组,与转染Ad-shPGC-1α高糖诱导组比较,细胞凋亡明显减少,有显著性差异(P<0.01)。结论:1.在人脐静脉血管内皮细胞中,PGC-1 α的表达与高糖环境下细胞增殖相关;高糖诱导下的人脐静脉血管内皮细胞增殖降低,同时PGC-1 α表达降低。2.下调PGC-1 α会进一步降低高糖诱导下的人脐静脉血管内皮细胞增殖,加重高糖诱导下的血管内皮细胞的凋亡;但是对正常环境下的脐静脉血管内皮细胞增殖与凋亡无影响;3.下调PGC-1 α加重高糖诱导的人脐静脉血管内皮细胞的线粒体膜损伤,膜通透性增加,线粒体膜电位去极化程度降低。4.下调PGC-1 α增加高糖诱导的人脐静脉血管内皮细胞细胞色素c释放和半胱氨蛋白水解酶活性,进一步阐明下调PGC-1 α加重线粒体膜通透性的改变。5.下调PGC-1 α导致的人脐静脉血管内皮细胞凋亡增加与Bcl-2及Bax两组蛋白、活性氧簇(ROS)及内质网应激(ERS)无关。6.下调PGC-1 α加重高糖诱导的人脐静脉血管内皮细胞凋亡是通过增加电压依赖性阴离子通道VDAC1活性起作用的。综上,在高糖环境下,缺乏PGC-1 α,激活了细胞凋亡的线粒体途径,导致线粒体膜电压依赖性阴离子通道VDAC1活性增加,加重了高糖环境下人脐静脉内皮细胞的损伤与凋亡。