第一部分MEN1与胃癌的相关性分析目的:检测MEN1在正常胃粘膜上皮细胞、胃癌细胞株、胃癌组织及癌旁正常组织中的表达,分析MEN1表达与胃癌的相关性。方法:1.收集胃癌临床标本及相应患者的临床资料,提取总RNA与总蛋白,同时制作组织蜡块。RTQ-PCR技术检测胃癌组织与癌旁正常组织中MNE1 mRNA的表达水平,应用Western blot与免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)技术检测组织中MEN1编码蛋白(Menin)的表达水平。比较MEN1在胃癌组织与癌旁正常组织中的表达水平,并进一步分析MEN1表达与胃癌临床病理特征的关系。2.收集永生化胃粘膜细胞GES1 及胃癌细胞株 AGS、MGC803、SGC7901、BGC823、HGC27,提取总RNA及总蛋白。RTQ-PCR与Western blot分别检测细胞中MEN1 mRNA与蛋白的表达,并分析MEN1的表达水平与胃癌的相关性。结果:1.免疫组化结果:MEN1在组织细胞中的表达有分布差异,MEN1在癌旁组织中主要是在核内分布(P<0.0001),而癌组织中主要在胞质分布(P<0.0001)。2.胃癌组织及其癌旁组织的qPCR及WB结果:癌旁组织MEN1表达量高于胃癌组织(qPCR,P=0.026;WB,P=0.035)。3.MEN1在细胞株的表达qPCR及WB结果:MEN1在胃癌细胞株的表达低于正常胃粘膜上皮细胞株,MEN1在GES1中表达量最高,而胃癌细胞株不同程度地低表达(P<0.0001)。4.MEN1与胃癌临床病理特征的关系:IHC结果中,阳性表达例数(癌组织评分/癌旁组织评分≥1)为19例;胃癌组织MEN1在淋巴结转移组的阳性例数比例较无淋巴结转移组的低(P=0.017);Ⅲ-Ⅳ期MEN1的表达较Ⅰ-Ⅱ期少(P=0.042);胃癌组织中MEN1低表达与胃癌较差的临床病理分期和伴有淋巴结转移密切相关(P<0.05),而与其性别、年龄、分化程度及肿瘤大的相关性不显著(P>0.05)。结论:1.MEN1在胃癌组织中低表达,而在癌旁组织高表达。2.MEN1在胃癌细胞系 AGS、SGC7901、MGC803、BGC823、HGC27 中相对 GES1为低表达。3.MEN1的低表达水平与胃癌的淋巴结转移及晚期临床病理分期密切相关。第二部分MEN1基因沉默、过表达载体及稳转细胞株的构建目的:构建MEN1基因沉默、过表达慢病毒载体及相应的稳转细胞株。方法:1.根据siRNA设计原则,设计两条并采用化学合成法合成siRNA;用Lipofectamine 3000进行siRNA转染细胞,48小时后,以qPCR方法检测MEN1的沉默效率,择其优者以构建慢病毒载体质粒。2.根据筛选到的靶点,合成shRNA之后,再将目的片段连接装载进载体质粒,转化感受态细胞之后,挑选单克隆菌落进行测序,测序正确之后,扩大培养,提取质粒备用;过表达质粒则购自广州复能基因公司;3.以第三代慢病毒包装体系(pMDLg/pRRE、pRSV-Rev、pMD2G)、293T 细胞、Lipofectamine 3000进行慢病毒包装,进行纯化之后,再感染胃癌细胞,并以抗性基因筛选法构建沉默及过表达MEN1基因的转稳细胞株。结果:1.经验证,siRNA-1 CTGTACCTGAAAGGATCATAC、siRNA-2 GCTGCGATTCTACGACGGCAT在AGS细胞系对MEN1的抑制率分别为83.13%、80.59%(P<0.0001),在MGC803 细胞系对MEN1的抑制率 86.70%、82.30%(P<0.0001),siRNA-1的沉默效果最好。2.成功构建重组慢病毒载体包装质粒。3.过表达及沉默重组慢病毒载体包装成功,慢病毒载体的滴度为:1.2E+8TU/mL。4.慢病毒转染AGS及MGC803胃癌细胞,并成功构建稳定沉默及过表达MEN1的细胞株及相应的阴性对照细胞株,qPCR检测AGS及MGC803细胞与对照组及空白组相比,MEN1的沉默效率均达到90%以上(P<0.0001);AGS及MGC803细胞与对照组及空白组相比,MEN1分别过表达14.8、15.6倍(P<0.0001);WB验证结结果显示:AGS、MGC803的过表达倍数分别为2.03倍、1.85倍,而沉默之后MEN1表达降低均达 3 倍(P<0.001)。结论:成功构建稳定低表达及过表达MEN1基因的胃癌细胞株AGS-OE、AGS-KD、MGC803-OE、MGC803-KD,为后续实验奠定基础。第三部分MEN1对胃癌细胞生物学行为的影响目的:探讨MEN1基因对胃癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移能力的影响。方法:在慢病毒稳转株的基础之上,在体外利用CCK8、克隆形成能力检测胃癌细胞的增殖能力,流式细胞术检测胃癌细胞的凋亡率,以划痕实验检测胃癌细胞的迁移能力,以transwell小室涂抹基质胶检测胃癌细胞的侵袭能力。MGC803沉默及过表达MEN1基因后,进行裸鼠足底移植及尾静脉注射,测量移植瘤体积,用HE染色比较肺转移情况。结果:1.沉默MEN1基因后,与对照组比较,AGS、MGC803胃癌细胞的增殖能力显著增强(P<0.05);迁移侵袭能力显著增强(P<0.05);而过表达MEN1基因后,与对照组相比,胃癌细胞的增殖能力显著减弱(P<0.05);迁移侵袭能力显著下降(P<0.05);而沉默及过表达MEN1基因后,AGS及MGC803胃癌细胞的凋亡率无显著差异。体内实验:沉默MEN1基因后,裸鼠足底移植瘤增殖速度加快,且促进肺转移;过表达MEN1基因可抑制足底移植瘤的增殖及肺转移(P<0.05)。结论:MEN1基因可抑制AGS、MGC803胃癌细胞增殖、迁移、侵袭能力,而对凋亡无影响。第四部分RNA-Sequence技术筛选MEN1过表达与沉默胃癌细胞株中差异表达的基因目的:筛选MEN1基因的下游调控靶基因。方法:在前期构建的稳定转染株的基础上,提取AGS、AGS过表达株、AGS沉默株的总RNA,采用Illumina HiSeqTM 2500高通量测序技术,设置对照组、过表达MEN1基因、沉默MEN1基因的三组细胞样本进行mRNA测序和分析,筛选MEN1基因在胃癌细胞中的相关下游靶基因。结果:测序成功,筛选正向调控候选基因:HSPA6、PLOD2、ROS1;负向调控基因:ELF5、STAB1、KLK5、CTNNA3、LAG3、P2RY2,总共9个;经qPCR验证后,HSPA6在过表达及沉默组中的相对表达量分别是(29.241±2.006),(0.676±0.091),重复结果最好(P=0.0025),其他基因表达趋势与测序结果不相符,且重复性欠佳。结论:本部分筛选到MEN1基因的下游调控靶点HSPA6,但尚需进一步实验验证。第五部分MEN1调控胃癌细胞的增殖、侵袭与迁移能力的相关信号通路探讨目的:探讨MEN1基因影响胃癌细胞增殖、侵袭与迁移能力的相关信号通路调控机制。方法:我们已知MEN1基因与胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭相关,且MEN1基因干预之后,初步筛选得到HSPA6基因与MEN1正相关,因而我们在此基础之上,用生物信息学方法,并查询KEGG数据库,结合文献查阅,选择 HSPA6、JNK/p-JNK、JunD/p-JunD、E-Cadherin、snail、vemintin、MMP2分子,主要采用Western blot方法检测并分析这些通路信号分子变化情况。结果:在AGS及MGC803细胞中,MEN1基因过表达之后,HSPA6蛋白与 E-Cadherin 表达上调,而 p-JNK、JunD/p-JunD、snail、vemintin、MMP2表达下调;MEN1基因沉默后,HSPA6蛋白与E-Cadherin表达下调,而 p-JNK、JunD/p-JunD、snail、vemintin、MMP2 表达上调。结论:MEN1干预之后,HSPA6在蛋白水平的改变与转录水平一致;而JNK/JunD主要以磷酸化改变为主,MEN1可能通过HSPA6/JNK/JunD信号轴调控胃癌细胞的增殖与侵袭转移能力。