前列腺癌是北美国家男性中最常见的恶性肿瘤之一,2008年美国新确诊为前列腺癌的患者占该年新确诊为恶性肿瘤患者的25％。在中国,随着人口结构逐步老龄化,前列腺癌的发病率也在逐年增高。　　肿瘤血清标志物的是目前研究的热点。理想的肿瘤血清标志物应该有如下的特点:能够区分高危与健康人群,能够用于肿瘤的诊断,方法简单、成本低廉,能够用于肿瘤的临床分期评估,能够用于肿瘤的治疗效果评估,能够用于预测肿瘤的转移与复发。　　PSA是目前应用最为广泛的前列腺癌血清标志物。自从PSA筛查开展以来,虽然前列腺癌的新发病例逐年增加,但进展期的局灶性和伴有转移前列腺癌的病例却急剧下降。除此之外,血清PSA水平与前列腺癌一些重要的病理过程密切相关,例如肿瘤大小,淋巴结转移,肿瘤穿透包膜和侵犯精囊等。尽管PSA筛查带来了诸多好处,但近年来也饱受争议和质疑。近些年来,发现 PSA检测的对前列腺癌的特异性较差,良性前列腺增生和前列腺炎患者的血清 PSA也会有所升高。PSA是前列腺特异性,而非前列腺癌特异性的。PSA变化速率等检测方法,特异性虽然有所提高,但仍然不理想。其次,实施血清 PSA筛查,存在前列腺癌“过度诊断”的问题。美国男性一生中罹患前列腺癌的概率为16％,而大多的前列腺癌具有缓慢的生长方式和低度的侵袭行为,真正的致死率仅有9％。除此之外,血清PSA水平在4-10ng/ml之间属于灰区,难以区分前列腺的良性病变与恶性病变。有25％前列腺癌患者血清PSA水平处于这一范围之内,还有15％前列腺癌患者血清PSA水平低于4ng/ml。2009年,《New Engl J Med》发表的研究显示,在美国,在过去的7-10年间开展的PSA筛查并未减少55岁以上前列腺癌患者的死亡率。还有一些标志物,或者临床应用较为局限,或者效果不是很理想。寻找能够替代PSA或弥补PSA缺陷的血清诊断标志物是十分必要的。　　分泌蛋白质组是指能分泌到细胞外的全部蛋白质总和,其广义的含义为通过多种方式、能够“释放”到细胞外的全部蛋白质。肿瘤细胞分泌蛋白中的一部分可以释放入血,成为潜在的血清标志物。质谱技术为肿瘤标志物的发现提供了一个庞大的蛋白质序列数据库。直接对恶性细胞的分泌蛋白进行分析,对鉴定血清中的恶性肿瘤标记物来说是一个更高效的方法。　　为了寻找更特异,或者能够弥补 PSA缺陷的前列腺癌血清标志物,我们运用分泌蛋白质组学,首先利用双向电泳-质谱技术鉴定细胞外蛋白,然后在细胞水平实验验证得到的分泌蛋白,最后利用前列腺癌动物模型验证得到的分泌蛋白,并通过检测人血清标本,评估血清标志物的价值。　　首先对细胞损伤进行了严格的控制后,获得了可信的LNCaP、C4-2和PC3三个前列腺癌细胞系及雄激素诱导与撤出条件下LNCaP细胞的胞外蛋白双向电泳图谱,对染色阳性的蛋白质斑点进行检测,每块凝胶大约可以获得400个左右银染的点。然后利用PDquest软件进行背景消减、标准化和匹配分析,选取重复性和分辨率都较好,且差异较为稳定的6个斑点进行了高分辨率质谱鉴定,发现了7个候选分子TPI1、THBS-1、PGAM1、SPON2、ST1、NPM1和PRDX1。　　由于一些候选分子不含有经典的信号肽结构,也未见文献报道其是分泌蛋白，利用293T细胞外源表达对其可分泌性进行了验证。为了适应大规模构建,首先对pCDNA3.1-myc-his(-)B进行改构,获得了真核表达载体pCDNA3.1(-)reconstruct,使融合myc和his标签的目的基因克隆的过程得以简化,并且增加了限制性位点的可选择性。以定位于胞浆的内源性的β-actin为对照,我们证明了ST1、TPI、PRDX1、PGK1和uMtCK五个不含信号肽的分子是分泌蛋白;EphA3 variant2是受体酪氨酸蛋白激酶家族EphA3的截短突变体,缺少了跨膜区及其下游的结构,我们也同样证实了其为分泌蛋白。　　通过半定量RT-PCR结果和不同前列腺癌细胞系胞外蛋白用特异性抗体进行检测,我们发现THBS-1、PRDX1、NPM-1(15kD截短突变体CRA_c)、PC-1和EphA3 variant2均在C4-2细胞胞外培养基中较LNCaP高表达;SPON2具有前列腺癌细胞系特异性,仅在AR阳性的前列腺癌细胞系中表达。综合上文可分泌性验证的结果,我们确定了3个候选分子:SPON2、THBS-1和PC-1自身抗体。　　通过对包含10例正常前列腺和癌旁组织,19例良性前列腺增生,44例不同Gleason评分,不同WHO分级,带有或不带有转移的前列腺癌组织芯片进行分析,发现SPON2在前列腺癌组织中明显比正常组织和良性前列腺增生组织中阳性率升高,表达增强;更倾向于发现Gleason评分7～8分和WHO分级2级的前列腺癌;并且在发生转移的前列腺癌组织标本中染色增强。我们还发现前列腺癌中SPON2的染色强度与PSA呈正相关,但其表达与良性病变差异明显,远远优于PSA。我们建立SPON2可靠的ELISA检测方法后,通过对13例正常人,4例良性前列腺增生,72例前列腺癌患者进行分析发现SPON2在前列腺癌患者血清中上调;SPON2最有助于诊断Gleason评分(4-6)分的前列腺癌;还发现SPON2有助于对血清PSA水平小于10ng/ml前列腺癌患者的诊断。还发现在LNCaP胞外培养基中,SPON2的表达水平在雄激素的作用下变化不明显,考虑血清中SPON2的表达水平可能能反映在抗雄激素治疗过程中肿瘤真实的大小。　　应用商品化的试剂盒,从对10例正常人,107例前列腺癌患者和27例其他男性泌尿系癌症患者的分析中发现,THBS-1在男性泌尿系肿瘤患者的血清中明显升高,而且还有助于对血清PSA水平小于10ng/ml前列腺癌患者的诊断。在血小板聚集过程中,THBS-1会大量释放,因而血清THBS-1浓度很高。在前列腺癌和其他泌尿系恶性肿瘤患者血清中THBS-1的升高有可能是肿瘤的一种继发反应,而并非肿瘤细胞自身所产生,这点我们目前还没有证实。无论是在转录水平还是在胞外培养基中,THBS-1在雄激素非依赖和AR阴性的细胞系中表达均明显上调。因而对前列腺癌患者血浆检测有可能对预测肿瘤的雄激素非依赖进展有价值,但尚需收集大量患者血浆样品进行评估。　　还发现,PC-1自身抗体在前列腺癌患者血清中水平有所降低,可能对前列腺癌的治疗和预防有一定价值。　　总之，通过胞外蛋白质组研究,细胞水平筛选,实验动物水平和患者水平的验证,发现了两种前列腺癌血清诊断和病理诊断的候选标志物THBS-1和SPON2,体现出一定的独立临床价值和对PSA检测缺陷的互补性。