类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，RA)是一种病因未明，以慢性，对称性多关节炎为特点，可累及全身其它各器官组织，包括皮肤，肌肉，血管，神经，胸膜，心肌和淋巴结等的全身性自身免疫性疾病，又称类风湿病。在疾病发展过程中，性质类似肿瘤，且侵袭破坏骨关节，终致关节强直、畸型、功能丧失等不同程度的残疾。各民族医务人员在积极寻求其致病根源及有效治疗方案，以减轻劳动力丧失和致残，最终根治本病，造福人类。 在RA的发病机制中，滑膜细胞周期失调，增殖与凋亡失衡，炎症因子异常分泌，致关节滑膜过度增殖形成血管翳，滑膜炎症状持久存在，出现关节肿胀、疼痛等等一系列临床症状，甚至多系统受累。本研究从加味汤的药效学、加味汤对动物模型细胞因子的影响、加味汤对滑膜细胞周期(增殖/凋亡)的影响以及观察对RA患者的疗效等方面。系统分析加味汤治疗RA的机理。为系统化和规范化使用本方、开发治疗该病的新药，提供可靠依据。 方法： 实验部分： 对动物模型的影响(1)镇痛药效学方面采用热刺激法观察加味汤的镇痛作用：选用体重200g左右雄性SD大鼠24只，随机分为加味汤组、消炎痛组、生理盐水对照组等3组，用辐射热测痛仪分别于给药后0.5h、1h、2h后，测定痛阈，计算给药后痛阈变化百分率。并统计其组间差异。(2)抗炎药效学方而采用大白鼠足跖浮肿法观察加味汤的抗炎作用，选用体重200g左右的SD雄性大鼠32只，随机分为：加味汤组、消炎痛组、空白模型组、正常组等四组。每日灌胃一次，共8日，于第8日灌胃前，测量足跖厚度，灌胃30分钟后，于大鼠右后足跖部皮内注射完全弗氏佐剂0.1ml(正常组免注射)致炎。于致炎后第一、二、三天用游标卡尺测量右足跖厚度。进行统计比较。(3)加味汤对大鼠模型细胞因子的影响采用PCR微板核酸杂交-ELISA方法，观察滑膜细胞IL-1βmRNA、IL-6mRNA基因的表达：40只Wistar大鼠，雌雄各半。体重200左右，随机分为四组。模型组：大鼠右后足趾皮内注射弗氏完全佐剂0.05ml致炎；激素组：造模后每只每日经腹腔注射0.2ml醋酸氢化可的松注射液(10mg/2ml)；中药组：造模后，加味汤2ml灌胃，每日1次；正常组：不造模。21天后，经眼眶静脉取血后处死，切开每只大鼠右膝关节囊，取关节滑膜组织10mg，留取血液与组织标本，以PCR微板核酸杂交-ELISA检测IL-1βmRNA、IL-6mRNA基因表达。 对滑膜细胞的影响采用MTT比色法、流式细胞仪、免疫组化法、TUNEL法等方法，观察大鼠成纤维样滑膜细胞株的增殖与凋亡。(1)用MTT比色分析法观察加味汤对细胞增殖的剂量效应与时间效应剂量效应：将生长状态良好的滑膜细胞株细胞常规消化，调整细胞浓度，加入96孔板，培养24小时，吸出培养液，分别加入浓度为80％、90％、100％、110％，、120％的和浓度为0.5、3.1、4.2、5.4、6.8umol/L的甲氨喋呤，每个浓度组重复3个孔。继续培养72小时，加入MTT，继续培养4小时使活细胞形成结晶，吸弃培养液，加入甲臢溶解液，于微型振荡器上，使结晶溶解，用酶标仪测各孔的OD值，根据OD值的变化来判断药物对细胞的剂量效应；时间效应：加观察药前的过程同剂量效应，加入观察药后的培养时间分别为24、36、72、96小时，观察各组各时点的细胞增殖变化，分析时间效应。(2)流式细胞仪观察滑膜胞增殖的细胞周期将生长良好的细胞消化，调整细胞浓度为，培养24小时，吸出培养液，加入含加味汤、甲氨喋呤的培养液，24小时后，用胰酶-EDTA进行消化，离心，PBS清洗，冷乙醇固定，作为样品，放入4℃冰箱保存待洲。流式细胞仪测定，测样前用荧光微球作为标准调整仪器，使其变异系数(CV)在2％以下，用样品加入10％鸡红细胞作为内参标准，与样品同步染色，加入碘化丙啶，在4℃冰箱染色，以500目铜网过滤，使样品成为合格的单细胞悬液，上机检测。计数各样品周期各时相的细胞比率。(3)免疫组化法观察滑膜细胞的凋亡基因表达将大鼠成纤维样滑膜细胞株生长良好的细胞消化，加入放有盖玻片的6孔板中，培养24小时，吸出培养液加入含加味、甲氨喋呤，继续培养72小时，取出盖玻片，多聚甲醛固定，用Bax试剂盒检测表达量。(4)TUNEL法观察滑膜细胞的凋亡将大鼠成纤维样滑膜细胞株生长良好的细胞消化，加入放有盖玻片的6孔板中，培养24小时，吸出培养液，加入不同浓度的加味汤、甲氨喋呤溶液，继续培养72小时，取出盖玻片，加TUNEL作用液、加POD转化液、DAB显色、苏木素衬染核、脱水透明封固。计数核呈棕色或黑色的细胞(凋亡细胞)、计算凋亡指数。 临床部分： 入选的病例全部为2004年5月至2005年10月，风湿免疫科门诊及住院患者。采用自身前后对照的方法，观察加味汤对类风湿性关节炎患者的疗效指标、安全指标的影响。 结果： 实验部分： 对动物模型的影响(1)镇痛药效学方面：给药0.5h、1.0h、2.0h后，加味汤对组大鼠的痛阈的分别为112.5±7.07％、150.63％±10.16％、154.38％±10.50％；消炎痛组大鼠的痛阈分别为123.75％±6.94％、165.0％±20.70％、163.75％±18.66％；生理盐水组大鼠的痛阈分别为：99.38％±7.76％、95.0％±11.95％、96.88％±7.98％。加味汤与生理水组比较显著性有统计学意义，P＜0.05。与消炎痛组比较低于消炎痛组。P＜0.05。(2)加味汤的抗炎作用：在给药前、第一天、第二天、第三天大鼠足跖厚度，加味汤组为5.55mm±0.17mm、6.50±0.27mm、6.11±0.27mm、5.60±0.24mm；消炎痛组为5.52mm±0.28mm、6.81±0.20mm、6.51±0.27mm、5.99±0.14mm；模型组为5.54±0.13mm、7.51±0.24mm、7.20±0.16、6.70±0.10。加味汤组低于型组，P＜0.05。与消炎痛组比较无明显差别，P＞0.05。(3)加味汤对佐剂性大鼠关节炎滑膜细胞因子IL-1β、IL-6基因表达的影响：滑膜IL-1β的表达，正常组表达度为0.4262±0.0856、模型组为0.5242±0.1043、激素组为0.3406±0.0597、加味汤组为0.3602±0.0924、模型组高于正常组，激素组低于模型组，加味汤组低于模型组，两两比较显著性有统计意义p＜0.05。加味汤组与激素组比较显蓍性无统计学意义p＞0.05；滑膜IL-6的表达，正常组表达度为0.3673±0.0953、模型组为0.6009±0.1256、激素组为0.4944±0.1307、加味汤组为0.5026±0.1381，模型组高于正常组、激素组低于模型组、加味汤组低于模型组，两两比较显著性有统计意义p＜0.05。加味汤组与激素组比较显蓍性无统计学意义p＞0.05。 临床部分： 43例患者中，临床控制12例，占27.91％。显效22例，占51.16％。有效8例。占18.6％。无效1例，占2.33％。总有效率97.67％。 在临床研究中，加味汤对类风湿性关节炎患者安全性指标的改变中如：谷丙转氨酶、尿素氮等。治疗前后均在正常参考值范围，变化比较无统计学意义(p＞0.05)，神经毒性方面治疗期间及治疗结束出现肢体麻木人数、呼吸困难人数分别为：0人、0人。 结论： 对实验所得结果进行系统分析后得出以下结论； 1大鼠佐剂性关节炎特点是在8天后开始出现症状，20天左右达到炎症高峰，4周后，肿胀消退，出现关节结构改变，类似人的RA改变，是研究类湿性关节炎的简单方便的动物模型。 2加味汤的药效学方面对大鼠痛阈有提高作用，与消炎痛相比，在作用上有缓慢上升的趋势，即起效迟、维持时间长；对大鼠肿胀有抑制作用，其抗炎作用，强于消炎痛，这提示加味汤的镇痛、抗炎作用是多靶点、多环节的。 3加味汤具有抑制RA模型细胞因子的基因表达作用，炎症性细胞因子合成减少，炎症减轻，这是抗风湿的药效的基础环节之一，加味汤的作用程度与激素相当。 4加味汤在离体条件下的作用通过滑膜细胞株的系实验，提示加味汤对滑膜的作用是，通过调节bax和bcl-2基因表达，在细胞增殖的S期，抑制细胞的生长，促进细胞的凋亡，其作用与MTX相当。推测加味汤在体情况下，具有同样的作用，而起到抑制滑膜细胞的肿瘤样增生作用。这是抗风湿药效的另一个基础环节。 5加味汤对类风湿性关节炎患者的作用，通过患者的治疗前后的自身对照，疗效性指标得到改善，这与动物实验的抗风湿药效是一致的。实验结果可以推知，加味汤可能是通过抑制滑膜细胞因子基因表达，促进滑膜细胞凋亡等起到治疗RA的作用。 6加味汤对RA患者安全性指标无恶化作用，这在治疗RA药物中是突出的优势。本课题只是对中医药治疗RA病的初步研究，还有待于从多方面、多角度深入研究。