朱砂叶螨羧酸酯基因TCE2原核表达研究

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朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)是一种重要的农业害螨,在我国分布广泛,严重危害多种作物。目前化学药剂喷杀仍然是防治朱砂叶螨的主要手段,由于该螨具有世代周期短,繁殖力强,近亲交配率高的特点,随着农药的大量和不合理使用,使得朱砂叶螨的抗药性发展十分迅速。  酯酶(EC3.1.1.1)是一种能够催化水解羧基类脂的水解酶,在昆虫(螨)体内可分解外源或内源的有毒有害物质,或通过与这些物质相结合使其无法作用于标靶,是害虫(螨)产生抗性的重要因素之一。  本研究拟在前人已经克隆获得朱砂叶螨酯酶基因TCE2并发现其与抗药性密切相关的基础上,体外原核表达TCE2基因、获得目的蚩白并研究其对杀螨剂-阿维菌素的直接分解或结合效果,为酯酶基因TCE2介导朱砂叶螨抗药性提供直接证据。主要研究结果如下:  1、构建了TCE2的重组原核表达载体(pColdⅡ-TCE2、pET-28a-TCE2、pET-28a-TCE2q和pColdⅡ-TCE2q)并诱导表达:其中pColdⅡ-TCE2无目的蛋白表达,pET-28a-TCE2和pET-28a-TCE2q可检测到蛋白包涵体,pColdⅡ-TCE2q检测到可溶性目的蛋白。  2、可溶性重组目的蛋白经纯化后,以其特异底物α-乙酸荼酯(α-NA)进行活性测定,获得酶活性测定最适反应条件为温度30℃,pH值7.4;最适反应条件下测得重组蛋白比活力为483.3±71.8nmol/mg pro.min-1,Km为30.5.±5.9nM, Vmax为448.2±75.2 nmol/mg pro.min-1。  3、HPLC检测重组蛋白对200mg/L阿维菌素原药的作用,结果发现随着重组蛋白酶量的增加,相同时间处理的阿维菌素减少的量呈上升趋势;相同酶量不同处理时间阿维菌素减少的量并没有显著性差异。
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