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长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是生物细胞内一类长度大于200 nt,但并不具备编码蛋白质功能的基因转录产物。lncRNA不仅可以在表观遗传、转录水平和转录后水平等方面发挥着重要作用,而且还可以参与染色质的核内运输、原癌基因活化调节、免疫细胞分化以及免疫系统的调控等重要过程。最近几年,随着基因组测序技术的发展,lncRNA被广泛地关注和研究。家蚕是鳞翅目的模式昆虫,也是重要的经济类昆虫。雄蚕与雌蚕在产丝的经济效益上具有差异,因而其性别决定和性别差异一直是家蚕研究的一个重要领域。2016年,有研究者利用高通量测序技术,发现家蚕性别决定级联调控途径最下游的关键基因Bmdsx的基因区域内存在7个lncRNA,其中1条lncRNA与Bmdsx的第四外显子重叠。2019年,本课题组克隆了此lncRNA,发现具有三种不同的剪接形式,其中一种lncRNA与Bmdsx的第三内含子和第四外显子反向互补,并且这条lncRNA参与了Bmdsx的选择特异性剪接,将此lncRNA命名为Bmdsx-AS1。在本论文中,进一步通过转基因过量表达Bmdsx-AS1来检测其生物学表型和作用,同时通过研究其下游的调控途径以及鉴定其上游调控因子进而探讨其调控机制。本研究获得的主要结果如下:1、过表达Bmdsx-AS1转基因家蚕品系的获得及表型分析为了获得更多不同的过表达Bmdsx-AS1的转基因家蚕品系,来进一步探究Bmdsx-AS1的功能。我们利用本小组已经构建好的转基因piggyBac[3×P3-RED,Bmdsx-AS1]的重组质粒通过转基因技术重新注射蚕卵得到了过表达Bmdsx-AS1转基因的家蚕品系,并且通过qPCR技术检测转基因雌雄家蚕整蚕中的Bmdsx-AS1的表达量高于野生家蚕,说明Bmdsx-AS1在转基因家蚕中过表达成功。提取转基因家蚕的基因组,利用特异引物扩增和测序,发现过量表达Bmdsx-AS1的转基因家蚕品系的基因组插入到13号染色体,并且位于基因间区。将转基因饲养到G2代,化蛾后发现转基因家蚕雄性外生殖器的抱器的数目增加,而转基因雌性家蚕的外生殖器相比于野生型家蚕来说并没有明显差异。2、Bmdsx-AS1下游调控途径分析在2014年有文献报道,家蚕的A8腹节的发育受到EGFR信号通路的影响。家蚕雄性外生殖器位于家蚕的第八腹节处,过表达Bmdsx-AS1的转基因家蚕品系外生殖器的形态变化,那么Bmdsx-AS1是否会影响EGFR信号通路?我们取转基因家蚕和野生家蚕的雌雄外生殖器进行荧光定量PCR技术检测发现相比于野生型家蚕,在过表达Bmdsx-AS1的转基因家蚕的雌雄外生殖器中,发现EGFR信号通路配体spi,转运加工spi配体的star和rho基因、负反馈相关基因kekl以及与激活受体的水解和未激活受体的循环利用相关基因cbl,mop,和hrs的表达水平降低。说明过量表达Bmdsx-AS1,使得EGFR信号通路活性降低。利用RNAi技术降低家蚕个体内的Bmdsx-AS1的表达量,选取Bmdsx-AS1序列中的特异部分合成双链的RNA,将双链Bmdsx-AS1注射进五龄一天的家蚕幼虫内,48h后取材提取总RNA反转成cDNA。利用荧光定量PCR检测EGFR信号通路中相关基因,相比于对照组而言,spi、star、rho、cbl、mop和hrs这六个基因的表达量都升高,说明EGFR信号通路的活性升高。结合增量表达Bmdsx-AS1转基因家蚕和干涉Bmdsx-AS1的实验结果,推断Bmdsx-AS1通过调节EGFR信号通路来影响家蚕的外生殖器的发育。3、Bmdsx-AS1上游调控因子的鉴定为了进一步鉴定Bmdsx-AS1上游调控因子,我们利用Gen Bank数据库检索Bmdsx-AS1启动子区域的序列,并且预测了Bmdsx-AS1的启动子上的作用元件。结果显示Bmdsx-AS1启动子区域具有Abd-B结合的顺式元件。有文献报道Hox基因BmAbd-B会影响家蚕外生殖器的发育。我们研究结果显示过表达Bmdsx-AS1引起的家蚕外生殖器发生变化,而在Bmdsx-AS1的启动子区域也预测有Hox基因家族的Abd-B基因的结合位点。因此,我们利用双荧光素酶酶活实验检测Bmdsx-AS1的启动子活性。结果发现,BmAbd-B会降低全长Bmdsx-AS1启动子的活性。根据BmAbd-B结合Bmdsx-AS1启动子的结合位点,对Bmdsx-AS1的启动子进行不同长度地截短,截短的启动子相比于全长的启动子,启动子的活性升高,研究结果表明BmAbd-B可以调控Bmdsx-AS1的启动子活性。利用EMSA实验对Bmdsx-AS1启动子上BmAbd-B的结合位点进行检测发现,BmAbd-B可以特异性结合到Bmdsx-AS1的启动子上。之后在BmE细胞中增量表达BmAbd-B,Bmdsx-AS1的表达量下降,进一步证明BmAbd-B可以调控Bmdsx-AS1的表达。利用RNAi技术降低家蚕中BmAbd-B的表达量,发现在干涉BmAbd-B家蚕雄性个体中,Bmdsx-AS1的表达量上升,而与EGFR信号通路相关基因spi和rho的表达量下降。在雌性干涉个体中,Bmdsx-AS1的表达量下降,spi和rho的表达量上升。表明BmAbd-B会调控Bmdsx-AS1的表达量,从而影响了EGFR信号通路的活性。综上所述,本研究对家蚕中的lncRNA Bmdsx-AS1的功能及调控机制进行了进一步的探究。发现过表达Bmdsx-AS1转基因家蚕的雄性外生殖腺的抱器数目增加,并且增量表达Bmdsx-AS1或者干涉Bmdsx-AS1会影响EGFR信号通路的活性,并且Hox基因BmAbd-B可以特异性地结合到Bmdsx-AS1的启动子上,并且调控Bmdsx-AS1的表达。我们的研究结果暗示了一条潜在的调控通路,即Hox基因BmAbd-B调控lncRNA Bmdsx-AS1,从而从而影响下游EGFR信号通路的活性,最后影响家蚕的雄性外生殖器的发育。这些结果对理解家蚕外生殖器发育乃至性别分化的分子机制提供了线索和数据。