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自然界的植物为了满足生长与发育的需求可以根据外部环境的变化来相应地驱动特定基因在某组织部位表达,从而适应复杂且不断变化的生长环境。启动子是DNA序列中可以起始转录、识别RNA聚合酶并结合DNA,位于结构基因5’端上游区域启动基因转录的一段序列。植物基因启动子中有多种重要顺式作用元件,这些元件在转录水平上参与调节相应下游基因的表达,从而使植物可以抵抗外界环境的胁迫而更好的生长发育。据研究,当植物中启动子转录调控受到影响后,有可能会引起基因表达甚至会使其生长发育出现不良反应,所以研究植物启动子对于我们更好的了解基因转录调控的表达模式及其调控机制是非常重要的。本实验室以前的研究发现拟南芥β-葡萄糖苷酶19(Beta-glucosidase,BGLU19)基因启动子是具有种子特异性表达的启动子,它可以控制外源基因在植物种子中高效表达而非植物的其他部位中表达,以及避免在转基因植株中非特异表达所引起的能量负荷和物质浪费,减少对植物的不利影响。本研究将从分子水平上通过对AtBGLU19启动子进行缺失突变继而获得转基因拟南芥纯合体,以此来确定决定种子特异性表达元件和关键DNA区域,以及研究β-葡萄糖苷酶19基因启动子及其表达调控机制。本研究对AtBGLU19启动子中关键顺式作用元件分析后,进行AtBGLU19启动子各缺失序列的克隆载体和植物表达载体的构建,利用花序浸染法将其转化到拟南芥中,最后筛选出转基因纯合株系。GUS组织化学染色分析表明,所有缺失片段均能驱动GUS报告基因在At BGLU19启动子以及各缺失启动子的种子中表达。本论文的主要研究结果如下:(1)AtBGLU19启动子序列组织特异性元件分析。通过PLACE和PlantCARE顺式作用调控元件数据库分析AtBGLU19基因启动子的DNA序列后,本研究获得了一些与组织特异性表达相关的元件,主要有:2个ABRE元件、3个RY元件(RY1元件、RY2元件、RY3元件)、SEF4元件、SEF3元件以及ESP元件等。(2)AtBGLU19启动子及各缺失启动子缺失突变分析。与AtBGLU19启动子相比,不同的缺失启动子中的组织特异性元件都有减少,缺失启动子△AtBGLU19-1缺少了RY1元件和SEF4元件所在序列,△At BGLU19-2进而又缺少了SEF3元件所在序列,最短的△AtBGLU19-3还缺少了RY2元件所在序列。(3)成功构建了AtBGLU19启动子各缺失序列的克隆载体。根据AtBGLU19基因启动子的关键顺式作用元件序列分析结果,设计5’端缺失突变系列的扩增缺失启动子引物。后经PCR扩增,得到3个序列大小依次为562bp、424bp和264bp的缺失片段,依次将缺失片段命名为△BGLU19-1、△BGLU19-2和△BGLU19-3。扩增产物纯化后进行克隆转化,其质粒测序结果表明缺失片段正确克隆至载体。按照缺失序列长度从大到小的顺序将重组克隆载体依次命名为BGLU19P-1,BGLU19P-2,BGLU19P-3。(4)成功构建了AtBGLU19启动子各缺失序列的表达载体。将相应的表达载体分别与各缺失序列克隆载体进行酶切后的片段进行连接,并根据阳性克隆筛选、菌落PCR以及双酶切的电泳检测,获得阳性克隆后通过对比测序结果发现成功构建3个缺失片段的植物表达载体。根据其长度从小到大依次命名为p△BGLU19-1-GUS、p△BGLU19-2-GUS、p△BGLU19-3-GUS。利用花序浸染法将其转化到拟南芥中,最后筛选出转基因纯合株系。(5)AtBGLU19启动子及各缺失启动子不同组织部位GUS组织化学染色分析。根据观察不同长度的缺失启动子和AtBGLU19启动子的株系在不同组织中的染色情况及染色深浅的结果,发现AtBGLU19启动子和缺失启动子系列都可驱使下游GUS报告基因在种子中表达,表明它们都可以对基因表达产生影响。全长启动子AtBGLU19除了种子部位,其他部位均未染上色,缺失启动子的各个组织部位都有染色,其中264bp的最短缺失启动子△AtBGLU19-3在种子、幼苗、花以及角果中的染色最深。根据以上实验结果,推测调控GUS基因在种子中特异性表达的顺式作用元件主要存在于△At BGLU19-3中,△AtBGLU19-3启动子区段是AtBGLU19启动子功能发挥所需的关键DNA区段。但具体各元件之间对启动子的调控作用还需要通过突变启动子的活性研究等来进一步探究鉴定。