单核细胞增多性李斯特菌(简称单增李斯特菌)为革兰氏阳性、食源性胞内寄生菌,可穿过宿主胃肠道屏障、血脑屏障、胎盘屏障引起脑膜炎和流产等,致死率高达30%。单增李斯特菌发挥其致病机制需要一系列毒力因子的参与,从而破坏宿主的免疫防线和应激修复系统。硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)是一类广泛存在于细菌中的氧化还原蛋白,与细菌的抗氧化应激相关,且能够通过二硫键修饰参与蛋白质的折叠从而维持蛋白质功能。生物信息学分析显示单增李斯特菌可能编码含有一个硫氧还蛋白(Trx A,由lmo1233基因编码)。那么,李斯特菌作为重要的胞内寄生菌是否也利用TrxA抵抗体内外环境中的氧化应激并维持其氧化还原稳态?是否参与了重要功能蛋白的折叠修饰?因此,本研究重点探索了单增李斯特菌在适应体外环境及感染宿主过程中利用Trx A介导细菌抗氧化应激的生存机制;揭示了Trx A通过对重要毒力因子的氧化折叠修饰并协助细菌发挥致病力的分子机理;阐明了Trx A与细菌关键鞭毛调控蛋白MogR和GmaR的互作关系并介导细菌鞭毛形成的内在机制。本论文研究发现:(I)单增李斯特菌TrxA在巯基特异性氧化剂肼(diamide)的诱导下其蛋白表达水平极显著上调(P<0.001),缺失trxA后细菌在该氧化环境下的生长和存活能力极显著削弱(P<0.001),说明Trx A对于李斯特菌的抗氧化应激至关重要;(II)体外原核表达并纯化TrxA后发现该酶具有经典的硫氧还蛋白酶活性,可以高效且特异地将氧化态胰岛素(insulin)还原。在生物信息学分析基础上,通过氨基酸点突变技术将TrxA的两个可能关键氨基酸Cys28和Cys31分别突变成Ala后该酶活性均完全丧失,该结果首次证实李斯特菌TrxA亦属于经典的硫氧还蛋白酶家族,其中Cys28和Cys31为其关键氨基酸位点,决定了该酶的活性和功能;(III)细胞感染试验发现,缺失trxA后细菌在人肠道上皮细胞Caco-2上的黏附、侵袭及存活能力均显著削弱(P<0.01),值得关注的是,利用共聚焦荧光显微技术发现缺失株在感染Caco-2过程中招募宿主肌动蛋白Actin的能力明显受限,从而导致细菌无法在其两端形成粗壮的“彗星状尾巴”,造成其在细胞间的迁移能力显著降低(P<0.01),证明硫氧还蛋白Trx A对于李斯特菌在胞内感染和生存发挥了关键的作用。体内感染小鼠发现,trxA缺失或过表达均导致细菌在肝脏和脾脏中的复制及增殖水平显著降低(P<0.01),进一步研究表明Trx A在体内的表达水平受转录因子SigH严谨调控,证实Trx A介导的氧化还原平衡对于细菌发挥致病力尤为关键;(IV)利用全基因组转录谱测序发现,缺失trxA后共有270个基因的转录水平发生了显著变化(差异2倍以上),其中李斯特菌重要毒力基因plcA,mpl,actA,hly和plcB的转录水平下降尤为显著(P<0.01)。利用RT-PCR和Western blot验证进一步证实TrxA确实参与了对该些毒力因子的转录和表达调控。利用等温滴定量热(ITC)试验研究发现,TrxA与李斯特菌毒力中枢调控蛋白PrfA(单体含有4个半胱氨酸)在体外能够发生明显的放热式互作(K=4.00E±1.13E4M-1),推测Trx A参与了PrfA单体分子内二硫键的形成,进而折叠成具有正确结构的二聚体并发挥正常功能,该结果证实TrxA通过对PrfA的氧化还原修饰进而调控下游毒力因子的表达,从而最终介导李斯特菌的致病力。(V)体外运动试验发现,李斯特菌缺失trxA后导致其运动性完全消失,通过电镜观察证实缺失株无法形成鞭毛。ITC试验发现,TrxA在体外能够与鞭毛形成重要蛋白MogR(单体含有2个半胱氨酸)发生吸热式互作(K=1.28E±1.56E4M-1),表明TrxA可能也参与了单增李斯特菌鞭毛形成的相关蛋白修饰及功能维持。因此,本项目首次运用生物信息学、分子生物学、蛋白质组学、感染生物学和细胞生物学等手段,探索了单增李斯特菌硫氧还蛋白Trx A在细菌体内外环境中的抗氧化应激机制,以及在感染宿主过程中通过对重要毒力因子的氧化还原修饰而参与细菌致病过程的分子机理,首次揭示了该蛋白通过对鞭毛调控蛋白MogR的修饰并介导细菌鞭毛形成及运动的分子机制。本研究对于揭示单增李斯特菌在体外氧化应激环境、宿主体内的抗氧化生存、二硫键稳态维持及氧化还原修饰机理以及维护人和动物健康具有重要意义。