视网膜变性疾病,如先天性视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性和青光眼等已成为目前眼科临床中主要的致盲眼病,严重影响着不同年龄段人群的视觉健康。各类视网膜变性疾病虽然在发病时间和临床表现上存在差异,但均以视网膜神经细胞程序性死亡为共同特点。目前对于该类疾病的发病机制尚不明确,且无促使视网膜神经细胞再生的有效方法,致使该类疾病治疗方法局限、疗效欠佳。干细胞移植作为该类疾病治疗中新的研究方向越来越成为关注的热点。干细胞移植通过向视网膜内移植入具有多向分化潜能的干细胞并诱导其定向分化,以补充患病视网膜中损失的神经细胞数量。在干细胞移植中,如何诱导干细胞在视网膜内定向分化成所需的神经细胞类型并形成有效的突触连接以发挥其对视觉信息的传递功能是成功的关键。因此探索视网膜发育过程中不同类型神经细胞产生及突触形成过程的基因调控网络是干细胞移植治疗开展的基础。　　小鼠视网膜因为其明确的层次结构、细胞组成以及与人类基因组的高度相似性被广泛应用于视网膜发育生物学和基因组学研究。目前已知视网膜中的各种神经细胞类型均由视网膜祖细胞(Retinal Progenitor Cells, RPCs)按照固定的顺序在特定的时期分化发育而来,虽然RPCs产生各类视网膜神经细胞过程的分化调控因素尚未完全明确,但已有的研究表明碱性螺旋-环-螺旋(Basic Helix-Loop-Helix,bHLH)转录因子在其中发挥着重要的作用。研究发现bHLH转录因子家族作用于中枢神经系统多种器官的发育过程,是中枢神经系统干细胞或前体细胞分化方向选择过程中的重要调控因子。前期研究发现bHLH转录因子家族成员Bhlhe22在成体小鼠视网膜中特异性的表达于视网膜伽马氨基丁酸能(GABA能)无长突细胞和Ⅱ型OFF-视锥双极细胞亚型,当Bhlhe22基因突变时,这两种神经细胞数量显著减少,但尚不明确Bhlhe22基因在小鼠视网膜发育过程中具体的调控功能及机制。同时前期研究还发现在Math5基因突变小鼠视网膜发育早期,当Math5基因表达缺失造成视网膜神经节细胞(Retinal Ganglion Cells,RGCs)大量减少的同时,Bhlhe22基因表达明显增高且伴有视网膜神经节细胞层(Ganglion Cell Layer,GCL)中Bhlhe22+异位无长突细胞数量的显著增加,由于GCL中的异位无长突细胞与视网膜内核层(Inner Nuclear Layer,INL)中的无长突细胞参与形成了视网膜发育早期的神经丛,因此Bhlhe22基因很可能作用于视网膜发育早期的突触形成过程,并在其中发挥着重要的作用。　　为了探索Bhlhe22基因对小鼠视网膜神经细胞产生和突触形成的作用,本项目进行了以下三个方面的研究:　　1、小鼠Bhlhe22细胞谱系追踪模型的建立。　　目的:利用Cre-Loxp重组系统,建立小鼠Bhlhe22细胞谱系追踪模型,并验证其有效性。　　方法:将含有Cre重组酶的Bhlhe22基因敲入小鼠Bhlhe22Cre/+与条件性报告基因小鼠Z/EG交配传代,制作小鼠Bhlhe22细胞谱系追踪模型Bhlhe22Cre/+;Z/EG。通过小鼠视网膜中EGFP的表达追踪Bhlhe22细胞谱系,并应用EGFP和BHLHE22抗体进行荧光共定位标记,以明确EGFP对Bhlhe22细胞谱系的标记效率。　　结果:通过对不同时期Bhlhe22Cre/+;Z/EG小鼠中EGFP表达的观察,发现EGFP能够同时标记Bhlhe22细胞谱系神经细胞胞体和突起,并且在小鼠视网膜发育的不同阶段均存在着Bhlhe22细胞谱系神经细胞。在小鼠胚胎发育时期,Bhlhe22基因表达于早期生成的RGCs、视网膜无长突细胞以及未分化的视网膜祖细胞或前体细胞中;在小鼠出生后至视网膜发育成熟阶段中,Bhlhe22细胞谱系神经细胞在GCL、INL和ONL中均有分布,根据细胞所处的不同层间及细胞形态推测为RGCs、视网膜无长突细胞、双极细胞和感光细胞。同时在对小鼠发育不同时期的视网膜切片及成体小鼠全视网膜铺片中应用EGFP和BHLHE22抗体进行荧光共定位观察时,发现在Bhlhe22Cre/+;Z/EG小鼠中绝大多数的Bhlhe22+细胞中同时存在EGFP的表达,说明Bhlhe22Cre/+;Z/EG小鼠中EGFP能够有效的成为Bhlhe22细胞谱系标记物。　　结论:Bhlhe22Cre/+;Z/EG小鼠能有效的成为Bhlhe22细胞谱系追踪模型,成体小鼠视网膜中EGFP的表达能全面反映视网膜发育过程中Bhlhe22基因的表达情况。　　2、小鼠视网膜Bhlhe22细胞谱系的追踪及鉴定　　目的:追踪小鼠视网膜发育过程中的Bhlhe22细胞谱系,并鉴定明确属于Bhlhe22细胞谱系的具体细胞类型。　　方法:选取视网膜发育成熟的出生后21天(P21)Bhlhe22Cre/+;Z/EG小鼠,免疫荧光组化方法分别标记EGFP和各种不同类型的视网膜神经细胞及亚型,通过观察EGFP抗体与视网膜神经细胞及亚型抗体的荧光共定位结果,明确在视网膜发育过程中存在Bhlhe22基因表达的细胞类型。　　结果:通过对P21 Bhlhe22Cre/+;Z/EG小鼠视网膜的研究发现EGFP+细胞分布于GCL、INL和ONL中,其中GCL中的EGFP+细胞少数为RGCs,多数为异位无长突细胞;分布于ONL中的EGFP+细胞为视杆感光细胞;分布于INL中的EGFP+细胞为无长突细胞和双极细胞。进一步利用无长突细胞和双极细胞亚型抗体标记发现,多数的EGFP+细胞为GABA能无长突细胞和OFF-视锥双极细胞亚型,少量的EGFP+细胞为甘氨酸能无长突细胞、ON-双极细胞和视杆双极细胞亚型。研究同时发现分布于视网膜不同层间的EGFP+细胞突起在IPL中形成四个独特的亚层排列。参与构成IPL中EGFP+亚层的细胞类型包括RGCs、异位无长突细胞以及部分无长突细胞和双极细胞亚型,并且IPL中EGFP+亚层的排列与GABA能无长突细胞在IPL中的树突排列相一致。　　结论:在小鼠视网膜发育过程中,Bhlhe22基因表达于RGCs、GABA能无长突细胞、甘氨酸能无长突细胞、OFF-视锥双极细胞、ON-双极细胞、视杆双极细胞和视杆感光细胞。多种Bhlhe22细胞谱系神经细胞,包括RGCs、异位无长突细胞以及无长突细胞和双极细胞亚型共同参与了IPL中的突触形成过程,且Bhlhe22细胞谱系神经细胞的突触连接主要通过GABA能无长突细胞相关通路形成。　　3、Bhlhe22基因对小鼠视网膜神经细胞产生和突触形成的作用　　目的:利用Bhlhe22基因突变模型,探索Bhlhe22基因对小鼠视网膜神经细胞产生和突触形成的作用。同时利用Math5基因突变背景下的Bhlhe22细胞谱系追踪模型,研究Bhlhe22基因在视网膜发育早期突触形成中的作用。　　方法:制作Bhlhe22基因突变模型Bhlhe22Cre/Lacz;Z/EG小鼠和对照组Bhlhe22Cre/+;Z/EG小鼠。分别在P21突变组和对照组小鼠中标记EGFP和各类视网膜神经细胞及亚型,观察Bhlhe22基因表达缺失条件下对视网膜神经细胞产生的影响,以及是否存在Bhlhe22基因主导的细胞命运选择过程。制作Math5基因突变背景下的Bhlhe22细胞谱系追踪模型Math5-/-;Bhlhe22Cre/+;Z/EG小鼠和对照组Math5+/-;Bhlhe22Cre/+;Z/EG小鼠,对比观察两组小鼠中Bhlhe22细胞谱系神经细胞的突触形成情况。　　结果:研究观察发现当Bhlhe22基因表达缺失时,原来广泛存在Bhlhe22基因表达的GABA能无长突细胞和OFF-视锥双极细胞数量明显减少,尤其是Ⅱ型OFF-视锥双极细胞亚型。这些神经细胞数量减少的同时伴有EGFP共表达细胞的显著减少,说明Bhlhe22基因为这些神经细胞亚型产生所必需。同时发现在部分只存在少量Bhlhe22基因表达的中间神经元亚型,如甘氨酸能无长突细胞和多巴胺能无长突细胞,当Bhlhe22基因表达缺失时,数量也明显减少甚至消失。其他存在Bhlhe22基因表达的细胞类型则无明显变化。研究同时发现突变组小鼠视网膜IPL中Bhlhe22细胞谱系神经细胞突起形成的四个亚层较对照组明显变细,尤其是IPL最外层与INL交界处,提示IPL中神经细胞突触数量的显著减少。而且当Bhlhe22基因表达缺失时,部分Bhlhe22细胞谱系神经细胞发生细胞命运改变而成为ChAT+胆碱能无长突细胞亚型和Calretinin+无长突细胞亚型。在Bhlhe22和Math5双杂合子对照组小鼠中EGFP+神经细胞间直至P0才出现由EGFP+细胞突起相互连接形成的突触连接;而在突变组小鼠中,EGFP+神经细胞间提前出现异常增强的突触连接,在胚胎发育E13.5和E16.5时便发现 EGFP+神经细胞的突起发育较对照组明显增强,且相互连接形成神经丛,与RGCs抗体的共定位标记提示这些提前出现并增强的突触连接发生在 Bhlhe22细胞谱系中的无长突细胞和异位无长突细胞之间。　　结论:Bhlhe22基因在小鼠视网膜发育过程中具有多种重要作用:包括Bhlhe22基因是GABA能无长突细胞、甘氨酸能无长突细胞、多巴胺能无长突细胞和OFF-视锥双极细胞正常产生的关键调控因子;并且视网膜发育过程中存在着由Bhlhe22基因所主导的中间神经元亚型命运选择过程;同时Bhlhe22基因的表达对小鼠胚胎视网膜发育早期的突触形成具有促进作用。