【摘 要】
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位于某些基因启动子区域和第一外显子区域的CpG岛经常出现异常甲基化,这种异常甲基化是失活或激活该基因的重要原因,而这些基因的异常表达逐步被认为是导致肿瘤出现的主要机制
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位于某些基因启动子区域和第一外显子区域的CpG岛经常出现异常甲基化,这种异常甲基化是失活或激活该基因的重要原因,而这些基因的异常表达逐步被认为是导致肿瘤出现的主要机制之一。本论文在调研已有的基于基因芯片技术的甲基化检测方法基础上,对基因芯片高通量的检测能力做了进一步探索,提出了三类高通量的DNA甲基化检测方法。
基于荧光杂交的DNA,甲基化芯片检测方法。在甲基化特异性微阵列检测方法基础上,采用荧光杂交技术发展了一种用于定量分析基因甲基化模式的寡聚核苷酸芯片。设计的6组寡核苷酸探针,覆盖了IGFBP7基因的启动子区上的18个CpG位点,共检测了15对乳腺癌组织,实验结果表明所有样本位点甲基化程度都在85%以上,与亚硫酸氢盐测序法检测结果一致。此外,发展了一种基于双色荧光杂交的高通量分析甲基化检测芯片,旨在低成本高效率分析大量样本以利于有效筛选生物标记物。此技术成功地检测27个样本的IGFBP7基因的甲基化状态。实验结果表明这种方法对于大规模甲基化定量分析具有较好的应用前景。
基于化学发光尼龙膜杂交的DNA甲基化芯片检测方法。本研究综合了尼龙膜固定DNA量大且固定效率高以及地高辛检测灵敏度高的特性,实现了对乳腺癌肿瘤样本的甲基化高灵敏度检测。通过直接参比阴性和阳性PCR产物的方法对检测的灵敏度进行了研究。实验结果表明这种方法能够有效地高灵敏度检测大规模低甲基化程度的样本。
基于滚环扩增的DNA甲基化检测方法。滚环扩增是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法,具有高特异性,高灵敏度,高扩增率,操作简单等优势,这为同时获得样本多基因的扩增产物提供了可能性,进而实现其甲基化检测。本论文研究了滚环扩增方法在甲基化检测中应用的可行性,实现了对IGFBP7阳性克隆和阴性克隆产物的检测,展望提出一种操作简单的高通量分析基因甲基化状态的芯片检测方法。实验结果表明滚环扩增技术在样本甲基化检测中是可行的,具有对样本多基因甲基化进行高通量检测的应用潜力。
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