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目的本课题研究大黄素对MCAO模型大鼠的神经保护作用,并且讨论大黄素调控PTEN/PI3K/AKT通路对缺血性脑卒中大鼠神经保护作用的影响,从分子生物学的层面探索大黄素脑保护作用的部分机理。方法(1)健康成年雄性SD大鼠60只,适应性喂养1周,随机分为假手术组(sham组)20只和造模组40只;造模组采用线栓法制作大鼠大脑中动脉梗塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,2h后再灌注,即为MCAO模型大鼠;造模成功后,抽签法随机分为MCAO模型对照组(MCAO组)20只、大黄素给药组(MCAO+Emodin组)20只。于造模lh后,对sham组和MCAO组大鼠灌胃0.5%羧甲基纤维素钠溶液(10ml · kg-1 · d-1),MCAO+Emodin组灌胃大黄素混悬液50mg · k-1 ·d-1(用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制),连续给药7d。Zea-Longa法对大鼠神经功能损伤评分;焦油紫染色法对神经细胞尼氏(Nissl)小体染色;RT-qPCR技术检测大鼠缺血侧脑组织炎症细胞因子mRNA表达水平;Western blot技术检测大鼠缺血侧脑组织NeuN、BDNF、NGF、Bax、Bcl-xl蛋白表达水平;免疫荧光技术检测大鼠缺血侧脑组织细胞凋亡、NeuN、NF200、CD44等指标。(2)从1日龄幼大鼠的大脑分离、培养星形胶质细胞,LPS(100ng/mL)诱导30min后,加入大黄素(10 μM),培养48小时,收集培养液和细胞,实验分为正常对照组(Normal组)、模型对照组(Model组)、大黄素给药组(Model+Emodin组),用ELISA法检测IL-6的含量,RT-qPCR技术检测炎症因子mRNA表达;培养BV2细胞,用LPS(100ng/mL)诱导30min后,加入大黄素(10 μM),培养48小时,收集培养液和细胞,实验分为正常对照组(Normal组)、模型对照组(Model组)、大黄素给药组(Model+Emodin组),用ELISA法检测IL-6的含量;取正常志愿者静脉血5ml,肝素抗凝,采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离PBMC,用培养基小心清洗未黏附的细胞,然后加入含有10%FBS,rhGM-CSF(1000U/ml),50U/ml青霉素和50 μg/ml链霉素的RPMI1640培养液,每2天置换一半新鲜培养液,培养7天,贴壁细胞即为巨噬细胞。巨噬细胞用LPS(100ng/mL)诱导30min后,加入大黄素(10 μM),培养48小时,收集培养液和细胞,实验分为正常对照组(Normal组)、模型对照组(Model组)、大黄素给药组(Model+Emodin组),用ELISA法检测IL-6的含量。(3)健康成年雄性SD大鼠72只,适应性喂养1周,随机分为侧脑室注射人工脑脊液36只,侧脑室注射PI3K抑制剂LY294002试剂36只,LY294002试剂注射量为10mM·kg-1,30 min后制作MCAO模型,2h后再灌注,即为MCAO模型大鼠;实验分为6组,即人工脑脊液+假手术组(sham组),LY294002+假手术组(LY294002+sham组),人工脑脊液+MCAO模型组(MCAO组),LY294002+MCAO模型组(LY294002+MCAO组),人工脑脊液+MCAO+大黄素组(MCAO+Emodin组),LY294002+MCAO+大黄素组(LY294002+MCAO+Emodin组),于造模lh后,对sham组、LY294002+sham组、MCAO组和LY294002+MCAO组口服灌胃0.5%羧甲基纤维素钠溶液(10ml · kg-1 ·d-1),MCAO+Emodin组和LY294002+MCAO+Emodin组灌胃大黄素混悬液50mg· kg-1·kg-1·d-1(用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制),给药1d,取大鼠缺血侧脑组织检测PTEN、AKT、NF-KBp50、Bax、Bcl-xl蛋白表达水平。(4)从1日龄幼大鼠的大脑分离、培养星形胶质细胞,用PI3K抑制剂LY294002预处理30min,LPS(100ng/mL)诱导30min后,加入大黄素(10μM),培养48小时,用ELISA法检测IL-6的含量,RT-qPCR技术检测炎症因子mRNA表达。结果(1)MCAO模型大鼠造模1h后,大黄素连续给药7d后,脑梗死体积明显降低,神经功能评分升高,Nissl阳性细胞数量增加,神经细胞凋亡数量减少,Western blot分析结果表明大黄素促进NeuN、BDNF、NGF、Bcl-xl蛋白表达,抑制Bax蛋白的表达,RT-qPCR分析结果表明大黄素能够抑制IL-6、IL-1β等炎症因子mRNA表达。免疫荧光染色结果显示,大黄素能够抑制NF200在胞体的数量,及抑制CD44的表达。(2)星形胶质细胞经LPS诱导后,IL-6含量升高,IL-6、IL-1 β、TNF-α等炎症因子mRNA表达升高,经大黄素作用48h后,能够逆转IL-6含量及IL-6、IL-1 β、TNF-α等炎症因子mRNA表达。BV2小胶质细胞经LPS诱导后,IL-6含量升高,经大黄素作用后,能够逆转IL-6含量。同样地,从人外周血分离的PBMC经诱导、分化而成的巨噬细胞,经LPS预处理后,IL-6含量升高,经大黄素作用后,能够逆转IL-6含量。(3)MCAO模型大鼠再灌注1h后,连续给大黄素6d,与sham组比较,MCAO模型大鼠缺血侧脑组织PTEN、AKT的蛋白表达明显降低,经大黄素作用后,能逆转脑组织中PTEN、AKT的蛋白表达,且具有显著性差异;为进一步探讨PTEN/PI3K/AKT通路对MCAO模型大鼠作用的时间点,研究发现MCAO模型大鼠再灌注1h后,给大黄素1d,与sham组比较,MCAO模型大鼠缺血侧脑组织PTEN、AKT的蛋白表达明显降低,经大黄素作用后,能逆转脑组织中PTEN、AKT的蛋白表达,且具有显著性差异。本课题通过侧脑室注射PI3K抑制剂LY294002,30min后造MCAO模型,1h后给大黄素,给药时间为1d,与MCAO+Emodin组比较,LY294002+MCAO+Emodin组p-AKT蛋白表达降低、NF-κ B p50及I κ B α核蛋白转录水平升高,Bcl-xl蛋白表达降低、Bax蛋白表达升高。(4)星形胶质细胞用PI3K抑制剂LY294002预处理30mmin后,LPS再诱导30min,大黄素给药组比较,LY294002+Emodin组IL-6的含量,炎症因子mRNA表达升高。结论(1)大黄素可以有效的减低MCAO模型大鼠的梗死体积,改善神经功能方面的损伤,有效的抑制神经细胞凋亡,并且能够逆转缺氧—再灌注所引起的基因表达方面的变化,具有神经保护的作用。(2)大黄素可以有效抑制星形胶质细胞、BV2细胞及巨噬细胞IL-6的含量,具有一定的抗炎作用。(3)大黄素对MCAO模型大鼠具有神经保护作用,其部分作用机制是大黄素通过抑制PTEN表达,激活PI3K/AKT通路,进而抑制炎症因子及神经细胞凋亡。