辣椒疫霉纤维素合酶CesA3基因的克隆、原核表达及遗传转化研究

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目前,辣椒疫病(pepper phytophthora blight)已成为影响辣椒生产的主要病害,不仅造成辣椒产量的降低,更给我国及其他国家带来了极大的经济损失。辣椒疫病是由辣椒疫霉菌引起的,辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)能够在土壤中长期存活且适应性强,对于该病菌的防治当前主要依赖农药。施用羧酸酰胺类(Carboxylicacid amides, CAAs)这一对卵菌病害防治效果杰出的杀菌剂,已成为防治辣椒疫病的主要方法。该类杀菌剂由肉桂酰胺、缬氨酰胺氨基甲酸酯和扁桃酰胺类3组化学结构各不相同的化合物组成。据已有的研究表明,这类杀菌剂的作用位点可能为编码纤维素合酶复合体。  本研究即主要围绕靶标蛋白纤维素合酶CesA3展开。通过克隆基因、构建表达载体等分子生物学手段,在大肠杆菌内表达该蛋白,并通过构建多种原核表达载体和更换不同表达菌株,摸索该蛋白的最佳表达条件,为以后进一步了解该蛋白特性打下基础。普通浮萍(lemna minor)是浮萍科植物的一种,为单子叶水生漂浮植物。由于浮萍根系在水中,与陆生植物相比较,对于水中溶解的化合物吸收效果更好。利用浮萍具有生长速度快、形态结构简单、生存环境条件易于控制的特点,本课题将浮萍应用到农药生物测定工作中。通过使用转基因技术在浮萍中表达外源细胞壁纤维素合酶,以转基因浮萍为基础,将传统的种辣椒、接菌、施药的农药生物学活性测定方法转变为使用含药培养液处理浮萍这种简单的方式。在克隆了辣椒疫霉纤维素合酶基因CesA3基础上,将其与植物表达载体pCAMBIA1301连接,用农杆菌介导的遗传转化方法侵染浮萍愈伤组织,获得转CesA3基因浮萍。经抗生素筛选和分子鉴定,得多株稳定的转基因株系。RT-PCR结果显示CesA3基因已在浮萍中转录。通过不同浓度梯度含烯酰吗啉药剂的Datko培养转基因株系一周,之后称取浮萍干重。通过数据处理发现转CesA3基因的株系抗药性高于野生型,进一步测定叶绿素含量也得出相近的结论。这为建立以转基因浮萍为检测对象的农药生物学活性评价方法奠定了基础。除了围绕纤维素合酶(CesA3)进行工作,还对本实验室合成的三种活性较好的杀菌剂的作用机理进行了实验,在离体活性方面测定了药剂对菌丝生长、孢子囊形成及萌发的抑制率。在活体活性方面测定了药剂对植物的保护、治疗活性和内吸性。通过收集整理数据发现,与商品化农药烯酰吗啉对比,wzp8-32样品综合防治效果接近烯酰吗啉,个别指标甚至优于烯酰吗啉。
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