目的：　　 酒精性肝病(Alcoholic Liver Disease，ALD)是长期大量酒精摄入所导致的肝脏病变，其病理生理过程十分复杂，目前有关ALD的发病机制尚不明了。近年来，大量的研究提示酒精可致肠道损伤、肠通透性增加，导致内毒素肠渗漏，是酒精性肝病的发病机制之一。内毒素(lipopolysaccharide，LPS)作为一类革兰氏阴性菌产生的脂多糖，具有高度的免疫活性，并能诱导细胞因子的产生，内毒素肠渗漏可引起二次攻击，诱导和加重肝损伤，同时，又加剧肠道黏膜屏障的损害，形成恶性循环。近期研究显示:慢性酒精摄入导致的肠道氧化应激、肠道通透性增高和内毒素血症要先于肝脏的脂肪变。因此，酒精所致肠道通透性改变的病理机制受到关注。目前研究中关于酒精性肝损伤时肠道通透性改变的病理机制有很多，均认为肠道通透性改变的根本原因在于肠道黏膜的损伤。完整的肠黏膜是防止细菌移位的基础和主要屏障。肠黏膜上皮细胞功能的失调可能是肠道通透性改变的重要原因。　　 叉头框蛋白O1(Forkheadbox O1，FOXO1)是叉头框转录因子家族中的一个成员，主要通过调控转录和信号传导途径发挥重要作用。FOXO1是调节细胞氧化应激反应及增殖、凋亡的重要转录因子。AKT也称为蛋白激酶B(PKB)，是一种相对分子质量为60，000的丝氨酸/苏氨酸激酶，与蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)具有相似性。活化的AKT直接磷酸化FOXO1转录因子，磷酸化/去磷酸化改变FOXO1蛋白的亚细胞定位。磷酸化的FOXO1蛋白被排除细胞核，其转录活性受到抑制，这是FOXO1转录活性受到负性调节的主要机制。目前认为FOXO1是调控细胞对抗外来异物和氧化损伤的关键转录因子，FOXO1缺失或激活障碍，会引起细胞对应激源的敏感性增高，作为新近发现的氧化应激反应重要的转录激活因子，在氧化应激反应中处于核心地位。　　 诱生型一氧化氮合酶(iNOS)作为肠道氧化应激的反应产物，其细胞毒作用导致细胞损伤，乙醇作为氧化应激的刺激因素之一，可以使iNOS表达增加，在乙醇诱导的Caco-2单层上皮细胞紧密连接蛋白下调和重排中起了重要作用。但是，乙醇是如何诱导iNOS表达，其具体机制有待于进一步阐明。本研究目的是为了进一步明确乙醇破坏肠上皮黏膜屏障的具体机制，PI3K/AKT-FOXO1信号通路在乙醇诱导的肠上皮细胞屏障功能中的作用，是否通过促进iNOS的转录，破坏紧密连接相关蛋白的表达和分布、导致肠粘膜屏障通透性的增高。　　 方法：　　 1、建立肠上皮黏膜屏障的体外模型，分别予不同浓度的乙醇作用于肠上皮黏膜屏障，分别用MTT法、LDH试剂盒检测Caco-2的细胞活性。　　 2、分别予不同浓度的乙醇作用于肠上皮黏膜屏障，测量肠上皮屏障的跨上皮细胞电阻值(TEER)和荧光黄透过率，检测体外肠上皮屏障的通透性变化。　　 3、应用Western blot法检测5％乙醇作用0-3h过程中，体外肠上皮屏障模型上紧密连接相关蛋白ZO-1和claudin-1的蛋白质表达水平。　　 4、应用Western blot法检测5％乙醇作用0min、20min、40min、60min及在60min时应用LY294002预处理后，紧密连接相关蛋白、(p-)AKT、(p-)FOXO1、iNOS的表达的变化。　　 5、应用Real-Time PCR法检测5％乙醇作用0min、20min、40min、60min及在60min时应用LY294002预处理后，体外肠上皮黏膜屏障模型FOXO1、iNOS的表达的变化。　　 结果:　　 1、成功建立了肠上皮黏膜屏障的体外模型，MTT法检测细胞活性显示，在≦5％浓度的乙醇作用下，不影响Caco-2细胞的活性;检测细胞培养液的LDH显示，1-10％浓度的乙醇在刺激Caco-2细胞1-3h的时间内对Caco-2细胞的细胞膜无破坏，选定5％乙醇作为刺激Caco-2细胞的适宜浓度。　　 2、不同浓度乙醇作用后，体外肠上皮黏膜屏障的体外模型的TEER值一过性降低，以5％的乙醇作用最明显，在60min达高峰，120min、180min随之增加，荧光黄透过率在60min达最明显，随之下降，选定5％乙醇刺激60min，作为破坏TJ的最大浓度和时间。　　 3、5％乙醇作用后，肠上皮黏膜屏障的体外模型上的上皮细胞紧密连接相关蛋白claudin-1由连续分布状态变为不连续分布状态。在60min时破坏最明显。　　 4、5％乙醇作用后，肠上皮黏膜屏障的体外模型上的上皮细胞紧密连接相关蛋白ZO-1、不可溶性claudin-1表达降低，在60min时下降最明显，而可溶性claudin-1表达增加，在60min时升高最明显，LY294002预处理可以抑制ZO-1、不可溶性claudin-1表达的降低及可溶性claudin-1表达的增加。　　 5、5％乙醇作用后，肠上皮黏膜屏障的体外模型上的上皮细胞的p-AKT/AKT、p-FOXO1/FOXO1升高，同样在60min达最高峰。LY294002预处理可以抑制p-AKT/AKT、p-FOXO1/FOXO1的升高。　　 6、5％乙醇作用后，肠上皮黏膜屏障的体外模型上的上皮细胞的iNOS活性显著升高。在作用20min时开始增加，60min时达峰值。LY294002预处理可以抑制iNOS活性的增加。　　 7、5％乙醇作用后，肠上皮黏膜屏障的体外模型上的上皮细胞的iNOS经Real-time PCR检测表达同样呈升高趋势，LY294002预处理使iNOS活性显著下降，说明5％乙醇在转录水平及对其产生影响。　　 8、5％乙醇作用后，肠上皮黏膜屏障的体外模型上的上皮细胞的FOXO1经Real-time PCR检测显示在0-60min表达无变化，LY294002预处理使FOXO1表达显著下降，说明5％乙醇在转录水平及对FOXO1无影响，而LY294002抑制FOXO1的转录。　　 结论:　　 1、乙醇作用后，降低体外肠上皮黏膜屏障的通透性，在1h内呈剂量和时间依赖性。　　 2、乙醇刺激后肠上皮黏膜屏障细胞间紧密连接的开放是肠上皮黏膜屏障通透性变化的原因。　　 3、紧密连接相关蛋白ZO-1和非可溶性claudin-1的表达下调是乙醇刺激后肠上皮黏膜屏障通透性变化的原因之一。　　 4、乙醇刺激1h后肠上皮黏膜屏障屏障通透性和紧密连接相关蛋白表达的变化与p-AKT/AKT、p-FOXO1/FOXO1的表达变化在时间上的密切关联，应用PI3K/AKT抑制剂后p-AKT/AKT、p-FOXO1/FOXO1及iNOS表达显著降低，提示PI3K/AKT-FOXO1信号通路参与了乙醇刺激后肠上皮黏膜屏障通透性变化和紧密连接开放的调控。