苎麻UDPGDH基因cDNA的克隆及功能分析

来源 :湖南农业大学 | 被引量 : 8次 | 上传用户:xiaok131
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苎麻(Boehmeria nivea)在我国有着悠久的栽培历史,是一种重要的纤维作物。为达到纺织要求,必须经过脱胶过程将苎麻韧皮中以果胶、半纤维素、木质素等为代表的胶质成分去除,不仅提高了生产成本,也容易对环境造成显著污染。因此,研究苎麻半纤维素和果胶合成的分子机理,从分子水平改善纤维作物的胶质成分,具有非常重要的理论意义和应用价值。前人的研究表明,尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(UDPGDH)是半纤维素、果胶合成代谢途径中的关键酶之一。在本研究中,采用现代分子生物学技术,克隆了苎麻UDPGDH全长cDNA;运用植物转基因技术,实现了苎麻UDPGDH基因在异源植株中的表达,并分析了其功能;初步建立了苎麻离体培养体系和遗传转化技术,为苎麻分子育种的深入研究奠定了基础。主要研究结果:根据对已知的UDPGDH基因序列同源性分析,设计简并PCR引物,以由湘苎三号中提取的总RNA反转录所得的cDNA为材料,扩增得到苎麻UDPGDH基因片段,运用RACE技术,获得总长度为1837 bp的UDPGDH全长cDNA序列(Gene Bank No.EF178294),其读码框编码的蛋白质含有480个氨基酸残基。采用生物信息学方法,对所获得的苎麻UDPGDH全长cDNA以及其所编码的蛋白质进行分析,结果表明,该基因及其所编码的蛋白质与已知的多种植物UDPGDH具有高度的同源性,其蛋白质结构中含有UDPGDH所特有的功能性结构域、酶活性部位关键残基及修饰位点,初步说明该基因为苎麻的UDPGDH全长cDNA。将所获得的基因克隆到质粒pET32和pMAL中,在大肠杆菌中表达获得该基因所编码的蛋白质,生物学活性研究表明,该蛋白质具有UDPGDH酶活性,从而证实所获得的基因序列为苎麻UDPGDH全长cDNA序列。为了研究UDPGDH基因的表达和纤维形成的关系,运用RT-PCR技术对苎麻UDPGDH基因在苎麻不同组织中的表达进行了半定量分析。结果表明,在苎麻根、茎、叶、皮中均可以检测到UDPGDH基因的表达,其表达水平按茎、皮、叶、根的顺序呈下降趋势,与上述组织中纤维成分的相对含量呈正相关。运用分子克隆的手段构建了苎麻UDPGDH基因的干扰、反义、正义表达载体,以农杆菌介导将其转化模式植物烟草(WS38),PCR检测结果表明转化阳性率分别达到了100%、90%、70%,证实外源UDPGDH基因片段已经整合到烟草基因组中,酶活性分析同样证实了苎麻UDPGDH基因在转基因植物中的表达。初步的组织学分析表明,反义和干扰表达的转基因植株中,茎段与叶横切面细胞结构较为松散,基本组织细胞间隙增大,而在UDPGDH基因过量表达的转基因植株中则观察到相反的现象,进一步证实UDPGDH基因在苎麻半纤维素和果胶合成中所具有的重要作用。以苎麻叶片为外植体,初步建立了苎麻的离体培养体系。湘苎三号形成优良愈伤组织的较优激素组合为:TDZ 0.3mg/L+2,4-D 0.01-0.03 mg/L,城步青麻为:TDZ 0.45 mg/L+2,4-D 0.03 mg/L、湘苎二号为:TDZ 0.15 mg/L+2,4-D 0.03 mg/L。湘苎三号诱导芽分化较优激素组合为TDZ 1 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L,城步青麻品种为TDZ 0.5 mg/L+2,4-D 0.3 mg/L,湘苎二号为TDZ 0.75 mg/L+2,4-D0.3 mg/L。同时采用叶盘法并对苎麻进行了遗传转化,获得了较多的PCR检测阳性苎麻植株。这些工作将为下一步苎麻分子育种研究打下了基础。
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