论文部分内容阅读
背景:糖尿病是一种内分泌系统的疾病,由异常高的血糖水平诊断,是世界上最常见和患者人数增长最快的疾病之一。在糖尿病防治的发展进程中,糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）是其中最经典的微血管并发症,然而目前的治疗方法特别是药物治疗,对治疗DR是有限的。因此,迫切需要开发新的DR治疗策略,寻求新的DR治疗靶点。在DR的早期阶段发现了炎症细胞的存在。随着DR的发展,持续的高血糖和缺氧的微环境诱导的过度持续的炎症介质加速了DR的发展。H19是一个保守的lncRNA,参与神经炎症及脑损伤等。H19在动脉粥样硬化和神经炎症中可通过介导炎症反应发挥重要作用,但H19在DR进展过程中对炎症的影响效果目前尚不清楚。miR-19b对机体的正常发育和疾病病理至关重要。有研究表明miR-19可明显介导炎症反应过程,miR-19b可能是无症状糖尿病患者患病的生物标志物。然而,miR-19b在DR中的调节功能及其机制目前还没有报道。沉默信息调节因子2相关酶1（Silence information regulator factor 2 related enzymes 1,SIRT1）是一种SIR2（一种组蛋白去乙酰化酶）的同源物,其与代谢综合症、肿瘤、神经退行性疾病相关,其也被认为是治疗DR等人类疾病的潜在靶点。据报道,有多种miRNA参与调节SIRT1。因此,探讨miRNA与SIRT1在DR发生发展之间的作用及机制,有助于DR预防及新治疗策略的开发。目的:本研究拟通过构建高糖（high glucose,HG）处理的人视网膜色素上皮细胞（adult retinal pigment epithelial cell,ARPE）ARPE-19模型,建立DR动物实验及研究临床DR人群,通过预测并验证H19、miR-19b和SIRT1之间的相互关系,探索H19、miR-19b和SIRT1在HG条件下,LncRNA H19是否可通过H19/miR-19b/SIRT1信号通路来抑制高糖环境下的炎症因子。这项工作为了解H19、miR-19b和SIRT1在DR形成过程中的作用及机制提供了新的见解,为临床治疗或预防DR及其相关的疾病提供了良好的思路及坚实的基础。方法:1、HG处理了ARPE-19细胞后,用qPCR、ELISA法检测了细胞内TNF-α、IL-6以及IL-1βmRNA以及蛋白的表达水平;qPCR和WB法检测了细胞中H19、miR-19b以及SIRT1表达的水平;2、qPCR法检测了miR-19b mimics及miR-19b inhibitor的转染效率;qPCR和ELISA法检测了干预miR-19b表达后对细胞中TNF-α、IL-6以及IL-1βmRNA及蛋白的表达水平;3、生物信息学法分析预测了miR-19b和SIRT1的结合情况,双荧光素酶报告基因系统对它们之间的相互作用进行了验证;qPCR及WB法检测了转染miR-19b的抑制及过表达模拟物后,细胞中SIRT1表达的情况变化;qPCR及ELISA法检测了抑制miR-19b表达及沉默SIRT1后,细胞中TNF-α、IL-6以及IL-1βmRNA及蛋白的表达水平改变。4、生物信息学法分析预测了miR-19b与H19的结合情况,使用双荧光素酶报告系统对靶向关系进行验证;qPCR法检测了过表达H19后,细胞中miR-19b表达的情况变化;q RT-PCR及ELISA法检测了过表达H19及过表达miR-19b后,细胞中TNF-α、IL-6以及IL-1βmRNA及蛋白的表达水平改变。5、qPCR及WB法检测了过表达H19及抑制SIRT1表达后,细胞中的SIRT1表达的改变;q RT-PCR及ELISA法检测了过表达H19及抑制SIRT1表达后,细胞中TNF-α、IL-6以及IL-1βmRNA及蛋白的表达水平改变。6、构建DR动物模型并对其进行H19过表达,检测小鼠中炎症因子、miR-19b以及SIRT1表达水平改变。7、qPCR检测DR患者及正常志愿者血清中H19、miR-19b以及SIRT1表达;Spearman相关性分析H19和miR-19b、miR-19b以及SIRT1之间的相关性。结果:1、qPCR及ELISA法表明,HG处理组的ARPE-19细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA及蛋白表达的水平均显著增加;HG处理组的H19和SIRT1在细胞中的mRNA及蛋白表达的水平均显著降低,而miR-19b在细胞中的mRNA及蛋白的表达水平则显著增加。2、在转染了miR-19b mimics后,细胞中miR-19b的表达则显著增加;在转染了miR-19b inhibitor后,细胞中miR-19b的表达被明显抑制;在转染了miR-19b mimics后,细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA及蛋白的表达水平显著增加,而在转染了miR-19b inhibitor后,细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA及蛋白的表达水平则显著下降;3、miR-19b和SIRT1相互结合;转染miR-19b mimics后,野生型SIRT1组中荧光素酶活性显著降低,而其对突变组中的荧光素酶活性并无影响;在转染miR-19b mimics后,细胞中SIRT1的mRNA及蛋白的表达显著降低,而在转染miR-19b inhibitor后,细胞中SIRT1的mRNA及蛋白的表达则有所增多;在仅抑制miR-19b表达时,细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA及蛋白的表达水平显著降低,而在同时转染sh-SIRT1后,炎症因子的mRNA及蛋白的水平降低均被完全逆转;4、miR-19b是H19的下游潜在靶标miRNA,转染miR-19b mimics后,野生型H19组中荧光素酶活性显著降低,而其对突变组中的荧光素酶活性并无影响;在过表达H19后,细胞中H19的mRNA表达水平显著增加,而miR-19b的mRNA表达水平显著降低;在仅过表达H19时,细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA及蛋白的表达水平显著降低,而在同时过表达miR-19b后,炎症因子的mRNA及蛋白的水平降低均被完全逆转;5、在过表达H19后,细胞中SIRT1的mRNA及蛋白的表达显著增加,而在同时抑制SIRT1表达后,细胞中SIRT1的mRNA及蛋白的表达增多则被显著逆转;在仅过表达H19时,细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA及蛋白的表达水平显著降低,而在同时转染sh-SIRT1后,炎症因子的mRNA及蛋白的水平降低均被完全逆转。6、在DR模型中,过表达H19小鼠组中炎症因子表达水平显著降低、miR-19b表达显著降低,而SIRT1的表达水平则显著增加。7、DR患者与正常志愿者相比,血清中H19和SIRT1的mRNA表达水平显著降低,而miR-19b的mRNA表达水平则显著增加;Spearman相关性分析结果显示,DR患者血清中H19与miR-19b及miR-19b与SIRT1均呈负相关。结论:LncRNA H19、SIRT1和miR-19b在HG条件下的ARPE-19细胞中差异表达;miR-19b靶向SIRT1,加重HG诱导的ARPE-19细胞的炎症反应;H19靶向miR-19b,通过H19/miR-19b/SIRT1信号轴,上调SIRT1的表达从而缓解HG诱导的ARPE-19炎症反应。DR动物模型中,H19可调控miR-19b及SIRT1的表达影响DR的炎症反应发生。DR患者中,H19与miR-19b及miR-19b与SIRT1均呈负相关。