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本课题以MHCⅡ基因的主要调控因子CⅡTA为靶分子，利用RNA干扰技术，抑制MHCⅡ基因的表达，观察对异体角膜缘移植排斥反应的影响。我们首先筛选了对MHCⅡ表达抑制最强的靶向CⅡTA的siRNA链，建立大鼠异体角膜缘移植模型，检测眼局部应用靶向CⅡTA的siRNA能否抑制异体角膜缘移植的排斥反应。从而评价RNA干扰抑制MHCⅡ表达的治疗效果以及siCⅡTA对植片存活的作用。
第一部分靶向CⅡTA的特异性siRNA的筛选
1目的
探讨靶向主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类抗原转录激活因子(MHCⅡtransactivatorCⅡTA)的化学合成小干扰RNA(smallinterferingRNA)抑制大鼠角膜基质细胞表面的MHCⅡ类抗原表达的可行性。
2方法
2.1大鼠角膜基质细胞的分离和培养
2.2大鼠角膜基质细胞siRNA的转染
2.3荧光定量PCR检测5条siRNA抑制CⅡTA基因、MHCⅡ基因RNA水平的表达效率
3结果
3.1大鼠角膜基质细胞中MHCⅡ和CⅡTA基因的沉默
3.2SiRNAs大鼠角膜基质细胞对MHCⅡ蛋白表达的影响
4结论
在大鼠角膜基质细胞中，靶向CⅡTAsiRNA抑制了自身mRNA表达，并阻止其调控的MHCⅡ类分子的相应表达。从而为进一步研究利用siRNA技术抑制MHCⅡ的表达防治角膜缘移植排斥反应提供了实验依据。
第二部分局部应用CⅡTAsiRNA延长异体角膜缘植片存活时间
1目的
探讨结膜下注射CⅡTAsiRNA对大鼠异体角膜缘移植发生免疫排斥反应的防治作用机制。
2方法
2.1动物和移植
2.2治疗策略
2.3Real-TimePCR确定异体角膜缘移植术后MHCⅡ表达的高峰时间点
2.4异体角膜缘移植体内应用CⅡTAsiRNA的效果
2.5组织病理学及免疫组织化学
2.6供体特异性DTH反应的评价
2.7细胞因子的定量分析
2.8检测供体上皮细胞的长期存活
2.9大鼠体内摄入CⅡTAsiRNA的研究
2.10分裂原刺激的淋巴细胞增殖反应
3结果
3.1生存时间的分析
与未治疗对照组(7.83±0.75天)和单纯接受Topviv对照组(8±0.62天)相比，局部应用CⅡTAsiRNA能有效延长角膜缘植片的平均存活时间(22.2±0.64天)
3.2异体角膜缘移植体内应用CⅡTAsiRNA的效果
CⅡTAsiRNA以剂量依赖的方式抑制MHCⅡ的表达，随着结膜下注射CⅡTAsiRNA剂量的增加，角膜及角膜缘植片MHCⅡ的表达量逐渐下降，呈递减的线性关系。40μg/μl为结膜下注射的最佳剂量。
3.3细胞因子的分析
角膜缘移植术后7天，14天，植片内与急性排斥反应病因相关的细胞因子例如IFN-γ，IL-2，在CⅡTAsiRNA局部用药组，IFN-γ几乎完全被抑制，而IL-2的表达也明显下降(与对照组相比较，分别下降降低＞5倍和＞2倍)。Th2类细胞因子IL-10的表达轻度增高，与对照组相比较，有统计学意义。治疗组中IL-10/IL-2的比值以及IL-10/IFN-γ的比值明显增高，与未治疗组相比，差异显著。
3.4供体特异性的DTH反应
评价Fisher344大鼠的供体特异性DTH反应。CⅡTAsiRNA治疗组受体与未治疗组相比较，耳肿胀度明显降低(p＜0.05)，表明CⅡTAsiRNA治疗导致了Th1型反应的抑制。
3.5组织学和免疫组织化学的检查
异体移植未治疗组的植片的组织学检查显示植片环基质层和受体角膜前基质层有明显的单核细胞的浸润以及新生血管的形成，而在异体移植CⅡTAsiRNA治疗组，植片环基质层和受体角膜前基质层的单核细胞浸润则明显减少。
免疫组织化学的研究表明，与异体移植未治疗组相比，异体移植CⅡTAsiRNA治疗组的CD4+，CD8+T细胞的数量明显减少。
3.6新生角膜上皮细胞来源的检查
通过检测雌性大鼠受体角膜上皮细胞DNA样本中的Sry基因来明确移植组新生角膜上皮的来源。在CⅡTAsiRNA治疗组中植片未排斥的角膜上皮样本中，从术后第五天到观察期结束时都能检测到阳性的Sry基因的表达。而移植未治疗组，在移植术后第7天，有87.2％的受体角膜上皮样本中就无法检测到Sry基因的表达。
3.7大鼠体内摄入CⅡTAsiRNA的研究
结膜下注射FAM标记的CⅡTAsiRNA，FAM标记的CⅡTAsiRNA能迅速被角膜以及角膜缘吸收，在结膜下注射后15分钟，在角膜上皮层就可见荧光表达，并持续表达48小时。
结膜下注射FAM标记的CⅡTAsiRNA24小时后，被检测的脾淋巴细胞中超过32％的淋巴细胞表现为荧光阳性。
3.8淋巴细胞增殖试验
CⅡTAsiRNA治疗组对供体淋巴细胞抗原的增殖反应能力较未治疗组明显降低，而且对ConA的反应能力也明显降低。
4结论
我们的结果表明在大鼠角膜缘移植的模型中，结膜下注射CⅡTAsiRNA能够明显延长异体角膜缘植片的存活时间。我们也能够推断CⅡTA的沉默在阻止同种异型T细胞活化起到一个良性的作用。CⅡTAsiRNA治疗组与未治疗组相比，角膜缘植片的生存时间明显延长，这为针对干扰MHCⅡ功能设计分子治疗方法，从而减少免疫排斥反应提供了理论依据。