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KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase)型碳青霉烯酶首次于2001年被报道,主要分布于肺炎克雷伯菌中。近年来,产KPC肺炎克雷伯菌(KPC-KP)菌株在全球多国家地区广泛流行,严重威胁人类健康。KPC-KP对几乎所有p-内酰胺类以及多种非p-内酰胺类抗菌药物耐药,使临床抗菌药物选择十分受限。近年来,磷霉素因对多重耐药菌株包括KPC-KP菌株仍有较好的抗菌活性而再度受到重视。我们前期研究发现浙医一院KPC-KP菌株磷霉素敏感率为43.4%,其中rmtB(质粒携带氨基糖甙类耐药基因,介导氨基糖甙类高水平耐药)阳性菌株仅为8.5%,然而他们对磷霉素的耐药机制尚不明确。本研究第一部分对浙医一院2010.1-2013.2间收集的97株KPC-KP菌株,通过琼脂稀释法测定其对磷霉素及其他抗菌药物的MICs值,PCR和基因测序检测耐药基因携带情况,脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)方法分析其克隆相关性,并选取代表菌株行转化接合试验分析磷霉素灭活酶基因fosA3定位及其携带质粒在菌株间传播情况。最后fos基因阴性菌株通过PCR及测序检测其磷霉素靶酶基因murA和转运系统相关基因glpA、uhpT、uhpA、ptsI、cyaA是否存在突变；同时通过碳源生长实验检测转运系统的功能。97株KPC-KP菌株中,共发现磷霉素耐药菌株57株(58.74%),其中44株为fosA3阳性,一株fosA阳性。其余12株不携带本研究中筛查的fos基因。这些菌株对所测抗菌药物包括碳青霉烯类、头孢菌素类、氨基糖甙类、喹诺酮类和四环素类皆呈高比例耐药,仅对多粘菌素E和替加环素表现出较高的敏感率,分别为100%和94.7%。57株磷霉素耐药菌株中50株携带rmtB基因,可以解释这些菌株对氨基糖甙类抗菌药物的高水平耐药。MLST共发现两个序列型(STs) ST11和ST494,前者包含56株,后者仅包含一株foS基因阴性菌株。PFGE共发现5个脉冲类型(PTS)。44株fosA3阳性菌株皆属于ST11-PTA,说明浙医一院fosA3阳性菌株为单克隆传播。而fos阴性菌株基因背景相对复杂,包括ST11-PTA(6株)、ST11-PTB(4株)、ST11-PTC(1株)和ST494-PTD(1株)afosA阳性菌株属于ST11-PTE.12株fos基因阴性菌株,靶酶基因未发现突变,且皆可在G-6-P为唯一碳源的M9培养基上生长,说明其磷酸己糖转运系统(UhpT)功能正常。4株磷霉素耐药菌株亦能在以G-3-P为唯一碳源的M9培养基上生长,说明其甘油-3-磷酸转运系统(G1pT)功能正常,其耐药机制需进一步研究。8株不能在以G-3一P为唯一碳源的M9培养基上生长,说明其G1pT系统存在功能异常,GlpT基因分析发现其中3株存在glpT基因及氨基酸序列改变,包含2株发生DNA的A477A突变,一株发生氨基酸Cys309Phe突变。其余5株未发现uhpT’基因序列改变,提示UhpT功能障碍可能与UhpT转录或表达水平下降有关。转运系统相关调节基因uhpA和cyaA未发现基因突变。而ptsl在12株磷霉素耐药菌株中普遍存在氨基酸改变Ile569Asn,结合碳源生长实验结果认为该突变为无义突变不影响ptsl编码蛋白功能。代表菌株KP1034磷霉素抗性不能通过接合实验传递到受体菌。其转化菌KP1034-T含有一大小约136kb的质粒,同时携带bldKPC-2、fosA3和rmtB基因,仅对替加环素、多粘菌素和喹诺酮类有足够的敏感性。基于第一部分发现pKP1034同时携带有blaKPC-2、fosA3和rmtB多个重要耐药基因,本部分从转化菌KP1034-T中抽提质粒pKP1034送上海迈普科技有限公司进行全质粒测序。然后对pKP1034全序列进行注解分析,并同相关质粒比对,查看其质粒骨架基因及多重耐药区基因组成及结构特点,探讨其演化过程。pKP1034为大小为136,848bp的闭合环形DNA分子,平均GC含量为54.5%。经过RAST注解共有191个阅读编码框,包含丰富的质粒稳定性相关基因和耐药基因(blaKPC、rmtB、fosA3、blaSHV-12、blaCTX-M-65、blaTEM-1和catA2),然而接合相关基因(tra基因)不完整,这与该质粒不能通过接合实验转移到受体菌大肠埃希菌J53相一致。该质粒为高度嵌合质粒,经质粒不相容群分析属于IncR-F33:A-:B-,可分为三个部分：携带catA2(氯霉素耐药基因)的复合转座子、tral和traB之间的片段(tral和traB皆为部分片段,被IS26截断)和余下的基因结构。第二部分traI和traB之间的片段跟国内流行fosA3阳性质粒pHN7A8高度同源,第三部分同台湾报道的肺炎克雷伯菌来源的blaKPC日性质粒pKPC-LK30高度同源。通过对PKP1034、pHN7A8和pKPC-LK30分析比较,可推测pKP1034的演化过程：pHN7A8中,携带catA2的复合转座子插入到tral基因中,同时另一份IS26插入到traB中,该IS26同catA2下游的IS26方向相同；②catA2下游的IS26同新插入的IS26发生同源重组,导致两份IS26中间的基因成分连同其中一份IS26从pHN7A8剪切下来,形成一个环形分子；③被切除的环形分子中的IS26同pKPC-LK30由blaSHV-11下游的IS26再次发生同源重组,从而使该环形分子插入到pKPC-LK30中；④pKPC-LK30中resD基因下游插入一个拷贝IS1,其与vagD基因下游的IS1(不完整基因)方向相同,二者之间发生同源重组导致中间基因结构连同完整的IS1基因被剪切下来,最终形成与pKP1034高度同源的质粒。其中,步骤③和④发生顺序可以改变。pKP1034和相关质粒多重耐药区(MRRs)深入比较分析发现：①pKP1034中携带fosA3. blaCTX-M-65和blaTEM-1的MRR部分与pHN7A8的MRR基本相同,只是在pKP1034中,IS1294被新插入的IS26截断,然后新插入的IS26与fosA3上游的IS26发生同源重组导致中间结构包括fosA3方向发生逆转；②pKP1034中携带fosA3和blaSHV-12的MRR部分与pKPC-LK30的MRR基本相同,但是pKPC-LK30携带blaSHV-11而非blaSHV-12,前者为非超广谱β-内酰胺酶,而后者为超广谱p-内酰胺酶,提示超广谱p-内酰胺酶blaSHV-12可能由blaSHV-11发生突变演化而来。③pKP1034中blaKPC的基因环境来源于国内流行的携带blaKPC基因的Tn3-Tn4401复合转座子,只是在pKP1034中,Tn3部分可能因为IS26介导的同源重组而被部分切除掉。结论：浙医一院KPC-KP菌株磷霉素耐药率较高(58.74%),其主要机制为携带(44株)灭活酶基因fosA3,另有一株携带fosA。这些菌株对所测抗菌药物皆高比例耐药,仅对多粘菌素E和替加环素表现出足够高的敏感率,分别为100%和94.7%。fosA3阳性KPC-KP菌株为单克隆传播,皆属于ST11-PTA型。代表菌株fosA3阳性质粒pKP1034为一高度嵌合的多重耐药质粒,由KPC阳性质粒pKPC-LK30和国内携带fosA3的流行质粒pHN7A8经经过IS26和IS1介导的多次同源重组演化而成。