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家蚕作为我国丝绸业的主要吐丝昆虫,在其生长发育过程中会受到多种病原体的侵害,例如细菌、病毒等。在感染家蚕的多种病毒中,以家蚕核型多角体病毒（BmNPV）对家蚕造成的损失最大。近年来已经研究报道有多种免疫通路参与昆虫体内的免疫过程,例如JAK/STAT通路、RNAi途径、Imd通路以及胰岛素样信号通路（insulin signaling pathway,ILS）等。当机体发生代谢响应时,会激活ILS通路从而调控糖脂代谢,此外,ILS通路在免疫上也具有非常重要的作用。研究发现昆虫受到饥饿影响时,会激活ILS通路中FoxO蛋白调控抗菌肽基因的表达抵抗微生物感染,AcMNPV病毒感染昆虫后会激活ILS通路中的PI3K-Akt通路来促进病毒繁殖。FoxO属于Forkhead转录因子家族中的O亚族成员,其存在于多种真核生物体内,参与多种生物学途径,包括细胞周期、抗氧化应激、基因组修复、代谢、免疫及凋亡和自噬等。FoxO是位于ILS通路中PI3K-Akt途径下游的转录因子,其转录活性受到PI3K-Akt通路抑制。已有研究发现果蝇FoxO（dFoxO）能够增强RNAi免疫途径,显著抑制RNA病毒;哺乳动物FoxO4也可以抑制乙型肝炎病毒（HBV）的启动子活性从而抑制HBV的繁殖,这些研究表明FoxO可以参与病毒感染后的免疫过程。家蚕体内只有一种FoxO,然而BmFoxO能否抑制BmNPV病毒及其作用机制尚无报道。因此本研究首先明确了家蚕BmFoxO受到BmNPV病毒感染的表达情况,然后通过在细胞及个体水平改变BmFoxO的表达量来探索对BmNPV病毒复制的影响,最后在家蚕BmE细胞中利用转录调控手段探索BmFoxO参与BmNPV病毒免疫的机制。主要研究结果如下:1.BmNPV病毒对BmFoxO表达的影响用携带绿色荧光蛋白的BmNPV病毒感染家蚕胚胎细胞（BmE）,在感染后不同时间点观察绿色荧光,并利用实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）检测BmNPV病毒拷贝数情况。结果显示,随着细胞感染病毒的时间增加,病毒携带的绿色荧光逐渐增加,并且在24h后携带绿色荧光蛋白的细胞达到20%,细胞内病毒繁殖拷贝数在感染6h后显著性增加,6h小时后随着时间逐级增加。将病毒感染BmE细胞和家蚕4眠起幼虫后,在不同时间点收集细胞及家蚕中肠RNA,qPCR结果显示,在细胞水平及个体水平,BmNPV病毒对BmFoxO有着明显抑制的作用。利用RNA双链干涉将BmFoxO表达量降低（dsBmFoxO）,dsBmFoxO处理BmE细胞后感染BmNPV病毒,发现BmNPV病毒的荧光水平、病毒拷贝数、转录水平及蛋白水平均增强。以上结果表明,BmNPV病毒感染家蚕后会抑制BmFoxO表达,并且降低BmFoxO表达量会增强BmNPV病毒的繁殖。2.过表达BmFoxO抑制BmNPV病毒繁殖为了进一步探索BmFoxO对BmNPV病毒的影响,我们利用已克隆出的BmFoxO进行三个磷酸化位点突变,获得具有组成性活性的BmFoxOCA,这种BmFoxOCA主要在细胞核内表达。将两种形式的BmFoxO过表达质粒(OE-BmFoxO、OE-BmFoxOCA)转染BmE细胞,48h后感染BmNPV病毒,检测BmNPV病毒的繁殖情况,结果显示,在家蚕胚胎细胞中,BmFoxO过量表达后,能够抑制BmNPV病毒的荧光水平、病毒拷贝数、转录水平及蛋白水平,说明过量表达BmFoxO可以显著抑制BmNPV病毒的繁殖,且BmFoxOCA的抗病毒能力比BmFoxO更显著。通过已获得的BmFoxO全身性过表达转基因家蚕,在家蚕4眠起时感染病毒,48h后将对照组家蚕及转基因家蚕提取整蚕基因组检测病毒拷贝数,统计感染病毒10天后每组家蚕的死亡率。结果显示,感染病毒后,转基因家蚕的病毒拷贝数比对照组低40%,而统计死亡率结果表明,相比于对照组51%的死亡率,转基因家蚕中的死亡率为37%,死亡率降低了14%。综上结果表明,BmFoxO过表达后对BmNPV有着显著的抑制作用,能够降低家蚕感染BmNPV病毒后的死亡率。3.BmFoxO参与BmNPV免疫机制初探已有研究发现斜纹夜蛾感染AcMNPV病毒后会增强p-Akt蛋白水平,而p-Akt对FoxO有较强的磷酸化抑制作用。我们在家蚕BmE细胞中感染BmNPV病毒,之后在不同时间点收集细胞总蛋白,检测BmNPV病毒对p-Akt蛋白的影响。结果显示,BmNPV病毒感染家蚕胚胎细胞后,会增强p-Akt蛋白水平,因此我们得知,BmNPV病毒通过增强p-Akt蛋白水平从而抑制BmFoxO的表达。为了探索BmFoxO参与BmNPV病毒免疫的相关机制,我们在细胞水平上研究过表达BmFoxO对细胞感染BmNPV病毒后的自噬及凋亡影响。结果表明,未感染BmNPV病毒时,过表达BmFoxO后可以微弱增强ATG6,ATG7,ATG8等自噬基因和Caspase8、Cytc、Caspase3等凋亡基因表达,而感染BmNPV后,过表达BmFoxO会显著增强以上相关自噬及凋亡基因的表达。为了确定转录因子BmFoxO是否通过BmPEPCK-2参与BmNPV病毒免疫,我们通过启动子缺失、EMSA、CHIP等实验检测BmFoxO是否调控BmPEPCK-2及结合位点位置,再进一步通过改变BmPEPCK-2表达量后检测病毒感染后细胞自噬（ATG6/7/8）及凋亡相关基因（Caspase8/3/1、p53、Cytc）变化。结果表明BmFoxO通过与BmPEPCK-2启动子上-1162～-1152bp处的ATAAATAAATA序列结合,诱导上调BmPEPCK-2的表达。检测病毒感染后的自噬和凋亡相关基因表达时,发现过表达BmPEPCK-2后会促进病毒感染BmE细胞后自噬及凋亡相关基因表达,而敲低BmPEPCK-2会抑制病毒感染BmE细胞后自噬及凋亡相关基因表达。综上结果表明,BmNPV感染细胞后增强p-Akt蛋白水平从而抑制BmFoxO,过表达BmFoxO后会诱导BmPEPCK-2表达增强,BmPEPCK-2会促进病毒感染细胞后的自噬及凋亡基因表达,从而抑制BmNPV病毒繁殖过程,增强家蚕的BmNPV病毒免疫。综上所述,我们发现BmNPV病毒感染家蚕后,会通过增强p-Akt蛋白从而抑制BmFoxO的表达,过表达BmFoxO后会诱导BmPEPCK-2上调表达,促进细胞受到病毒感染后的自噬与凋亡免疫途径,从而抑制BmNPV病毒的繁殖,降低病毒拷贝数和家蚕死亡率。本研究不仅进一步丰富了我们对FoxO参与病毒免疫机制的认识,同时也为以家蚕作为研究昆虫—病毒相互作用的模式生物提供了依据。