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研究背景及意义肝内胆管癌是一类来源于肝内胆管上皮的恶性肿瘤,目前位列肝脏恶性肿瘤的第二位,仅次于肝细胞癌,约占原发性肝脏恶性肿瘤的5%~10%,其发病率近年来呈不断上升的趋势。肝内胆管癌通常起病隐匿,发展迅速、恶性程度高且较早出现淋巴结转移,多数患者发现时已出现淋巴结广泛转移或者远处转移从而失去手术时机,而且大部分无法行手术治疗的患者在明确诊断后1年内死亡。由于患者缺乏特异性的临床表现,部分患者就诊时多处于中晚期,且肝内胆管癌对放化疗的敏感度较低,患者预后普遍较差。目前外科手术仍是治疗肝内胆管癌的首选手段,但已报道的术后5年存活率仅为20%~40%,而且可切除的病例只占30%~40%,因此积极探寻与肝内胆管癌进展相关的因子有可能为肝内胆管癌的靶向治疗提供新的思路和方向。脑源性神经营养因子(BDNF)是神经营养因子家族的成员,BDNF一般通过与原肌球蛋白相关受体激酶B(TrkB)受体或pan-NT受体p75(p75NTR)受体结合来调节细胞存活和分化,参与调控神经系统的发育和修复。近年研究表明BDNF不仅参与神经系统的分化发育,还和肿瘤的发生发展有关。目前有大量研究表明BDNF在前列腺癌、胰腺癌、肝细胞癌等多种癌症疾病中过表达,其异常表达与恶性生物学特征以及患者的术后预后密切相关。研究人员发现BDNF结合Trk B受体会使肿瘤细胞免于化疗药物诱导的细胞凋亡,而且Trk B与肿瘤转移的能力密切相关,上皮细胞表达的Trk B可特异性地抑制与天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶相关的失巢凋亡,从而激活PI3K信号通路诱导细胞的增殖,促进肿瘤转移。但是目前BDNF在肝内胆管癌中的表达及其对肿瘤恶性行为的影响还没有系统研究,进一步明确BDNF在肝内胆管癌中的表达及其促进肿瘤进展的机制有可能为肝内胆管癌的生物治疗提供有效的作用靶点。本研究以临床标本及肝内胆管癌细胞株为研究对象研究了 BDNF在肝内胆管癌标本和细胞中的表达,分析了 BDNF和临床病理特征之间的关系以及其预后意义;揭示了 BNDF促进肝内胆管癌增殖、迁移和侵袭的生物学作用以及通过增加VEGF合成和分泌促进肿瘤血管生成的分子机制。第一部分 脑源性神经营养因子(BDNF)在肝内胆管癌中的表达及其预后意义目的:探讨BDNF在肝内胆管癌细胞和组织标本中的表达;分析BDNF与临床病理特征之间的关系;揭示BDNF对肝内胆管癌患者预后的影响。材料和方法:收集正常胆管上皮和肝内胆管癌细胞株,western blotting检测BDNF的水平,收集细胞培养基ELISA检测其中BDNF的水平;收集山东大学齐鲁医院和单县中心医院普外科2002-2010年接受根治性手术切除的肝内胆管癌患者标本,免疫组化检测BDNF水平并统计病人的临床病理资料;Fisher检验评估BDNF与临床病理特征的相关性,Kaplan-Meier法绘制患者的生存曲线,应用Cox多因素比例回归模型来评价各个指标的预后意义。结果:肝内胆管癌细胞株BDNF水平明显高于HIBEpiC正常胆管上皮细胞株,其中RBE和HuCCT-l细胞表达量高于HCC C9810细胞株;96例肝内胆管癌标本其中有62例(64.6%)BDNF呈高表达,34例(35.4%)标本BDNF呈低表达;BDNF表达水平与神经浸润(P=0.007)密切相关,除此之外与病人年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、肝硬化、乙肝病毒感染、TNM分期因素等无显著相关性;Kaplan-Meier生存曲线以及Log-rank检验可知,BDNF高表达病人术后总生存率明显低于BDNF低表达病人(P=0.006),BDNF高表达是IHCC中独立的预后因素(P=0.032)。结论:BDNF在肝内胆管癌细胞株表达明显升高,免疫组化显示BDNF水平低表达和高表达组百分比分别为35.4%(34/96)和64.6%(62/96);BDNF表达水平与肝内胆管癌神经浸润显著相关(P=0.007)BDNF是肝内胆管患者术后的独立不良预后因子。第二部分 BDNF对肝内胆管癌细胞增殖、迁移和侵袭等恶性生物学行为的影响及其对肿瘤血管生成的机制研究目的:探讨BDNF对肝内胆管癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为的影响及其对肿瘤血管生成的作用及机制。材料和方法:分别用Si-RNA和BDNF干扰和过表达肝内胆管癌细胞株BDNF的表达,检测BDNF对细胞增殖、迁移和侵袭的影响;免疫组化检测不同BDNF水平的肝内胆管癌标本的微血管密度;收集对照和干扰BDNF表达的RBE无血清培养基用来培养HUVEC,观察BDNF对HUVEC在基质胶上成管能力的影响并检测培养基中VEGF和其他血管生成相关因子的表达水平。结果:分别用scrambled RNA和BDNF-siRNA小干扰片段转染RBE细胞,pc DNA3.1-vector 和pc DNA3.1-BDNF质粒转染HCCC9810,MTT实验显示BDNF能促进细胞的增殖;划痕实验和transwell小室实验表明细胞转染BDNF或给予外源性BDNF能显著增加细胞的迁移和侵袭能力;肝内胆管癌平均血管密度在BDNF高表达组标本中明显高于BDNF低表达组,BDNF能增加促进肝内胆管癌VEGF的合成和分泌,血管内皮细胞成管实验表明和对照组细胞相比,BDNF沉默组细胞的无血清培养基促进内皮细胞成管能力明显降低,以上差别具有统计学意义。结论:BDNF能显著增加肝内胆管癌细胞的增殖,迁移和侵袭能力;BDNF能增加肝内胆管癌VEGF的合成和分泌;内皮细胞体外成管实验表明和对照组相比,干扰BDNF能抑制的脐静脉内皮细胞的成管能力,表明BDNF可能是通过调节VEGF水平影响肝内胆管癌血管生成的。