论文部分内容阅读
血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）是神经血管单元（neurovascular unit,NVU）中一种独特的脑血管内皮结构,对于维持中枢系统的正常功能至关重要。BBB中的内皮部分是活性氧（reactive oxygen species,ROS）产生的主要场所。在永久性和可逆性大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）两种模型中,ROS的产生呈现不同的上升趋势。而ROS可以介导脑缺血引起的氧化损伤,损害脑血管内皮屏障的完整性并增高内皮细胞通透性。包括p38和细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,Erk）1/2在内的促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）的活化参与了短暂性MCAO（transient MCAO,t MCAO）后的缺血再灌注（ischemia-reperfusion,I/R）损伤过程。由MAPK催化的胞浆磷脂酶A2（cytosolic phospholipase A2,cPLA2）丝氨酸505位点磷酸化会上调cPLA2的酶活性,从而释放花生四烯酸（arachidonic acid,AA）,与脑缺血引起的氧化损伤和脑血管的通透性改变密切相关。血管内皮细胞产生的1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate,S1P）对于血管内皮完整性具有强效的调控作用,而1-磷酸鞘氨醇受体（sphingosine-1-phosphate receptor,S1PR）1、S1PR2和S1PR3是在内皮细胞分布的最重要的S1P特异性受体。与激动S1PR1和S1PR3对于血管内皮屏障的完整性具有保护作用相反,阻断S1PR2会降低血管内皮细胞旁通透性。更为重要的是,在脑I/R模型中,S1PR2的激动能够引起脑血管内皮细胞中基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）-9的活化,从而破坏脑血管内皮的完整并增大I/R后脑血管的通透性。促肾上腺皮质激素释放激素（corticotrophin-releasing hormone,CRH）及其神经肽家族成员能够对中风在内的多种刺激做出应答,而促肾上腺皮质激素释放激素受体（corticotrophin-releasing hormone receptor,CRHR）1是对于CRH具有高亲和力的G蛋白偶联受体。CRHR1拮抗剂可以减轻大鼠永久性局灶性脑缺血引起的脑损伤和脑水肿。CRHR1基因敲除小鼠在局灶性脑缺血后脑组织损伤也明显减轻,证明CRHR1是介导脑缺血损伤的关键分子。大鼠和牛的脑微血管内皮细胞均存在CRH受体的表达,受到CRH刺激后细胞中环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,c AMP）的含量会上升,提示CRH可能通过激动受体直接影响脑微血管内皮细胞的结构和功能,从而调控BBB的通透性。因此,CRHR1有可能参与调控脑血管内皮屏障的完整性。本文的研究目的是探讨氧化应激条件下S1PR2与CRHR1各自对于脑血管内皮细胞通透性的调控作用和两者之间的关系,并阐释分子机制。第一章S1PR2调控氧化应激条件下脑血管内皮细胞的通透性S1PR2和cPLA2都参与了脑缺血模型中脑血管完整性的破坏。然而,在脑缺血引起的内皮损伤过程中S1PR2对于cPLA2活性的影响尚不清楚。本章的研究目的是探讨S1PR2调控氧化应激诱导的脑血内皮屏障损伤的作用和潜在的分子机制。我们采用过氧化氢刺激的小鼠脑微血管内皮细胞b End3细胞和小鼠永久性MCAO（permanent MCAO,p MCAO）模型,分别在体外和体内模拟氧化应激对于脑血管内皮细胞的损伤,并使用了阻断剂和核糖核酸（ribonucleic acid,RNA）干扰技术研究氧化应激对于内皮细胞通透性的作用和分子机制。在b End3细胞中,S1PR2拮抗剂JTE013和cPLA2抑制剂CAY10502均可明显抑制过氧化氢诱导的细胞旁通透性和ZO-1定位的改变。过氧化氢通过激活Erk1/2和p38引起cPLA2的磷酸化,增大内皮细胞的通透性。S1PR2的阻断和敲减都能显著抑制过氧化氢诱导的Erk1/2、p38和cPLA2的磷酸化。在小鼠p MCAO模型中,我们发现JTE013的预给药明显减少了损伤侧脑组织伊文思兰染料（Evans blue dye,EBD）的外渗,并且逆转了该侧血管内皮型钙黏蛋白（vascular endothelial-cadherin,VE-cadherin）、occludin、claudin-5和CD31蛋白表达的下降。此外,JTE013的预给药还减轻了小鼠的神经功能缺陷、脑水肿和脑梗死体积。我们的实验结果说明氧化应激条件下S1PR2的激活通过p38和Erk1/2依赖的cPLA2磷酸化增加了脑血内皮的通透性。第二章CRHR1调控氧化应激条件下脑血管内皮细胞的通透性脑缺血诱导的氧化损伤参与了BBB的破坏。CRHR1的阻断和基因敲除在啮齿类动物局灶性脑缺血模型中具有神经保护作用。本章的研究目的是探讨CRHR1调控氧化应激引起的脑血管内皮屏障损伤的作用和机制。我们采用过氧化氢刺激的小鼠脑微血管内皮细胞b End3细胞和小鼠t MCAO模型,分别在体外和体内模拟氧化应激对于脑血管内皮细胞的损伤。我们使用了阻断剂和RNA干扰技术研究CRHR1调控氧化应激引起的内皮细胞通透性改变的作用和分子机制。在b End3细胞中,我们发现CRHR1的阻断和敲减都能明显地抑制过氧化氢诱导的Erk1/2、p38与cPLA2的磷酸化和细胞旁高通透性以及ZO-1的重新分布。在小鼠的t MCAO模型中,我们发现CRHR1拮抗剂NBI27914的预给药显著减少了损伤侧脑组织EBD的外渗,并且逆转了该侧内皮细胞间连接蛋白表达的下降。NBI27914的预给药也明显减轻了小鼠的神经功能缺陷、脑水肿和脑梗死体积。另外,在30分钟MCAO后再灌注的第七天,CRHR1的敲减减少了损伤侧脑组织海马区域EBD的外渗。这些实验结果表明氧化应激条件下CRHR1的激活可能通过p38和Erk1/2依赖的cPLA2磷酸化增加了脑血内皮的通透性。第三章CRHR1介导氧化应激条件下S1PR2对脑血管内皮细胞通透性的调控作用尽管S1PR2和CRHR1同属G蛋白偶联受体并分布于内皮细胞表面,但是,二者在氧化应激诱导的脑血管内皮屏障损伤过程中的关系一直不明。本章的研究目的是探讨CRHR1对于S1PR2调控氧化应激引起的脑血管内皮屏障损伤的作用和潜在机制。我们采用过氧化氢刺激的小鼠脑微血管内皮细胞b End3细胞和小鼠p MCAO模型分别在体外和体内模拟氧化应激对于脑血管内皮细胞的损伤,并使用了阻断剂和激动剂研究氧化应激对于内皮细胞通透性的作用和分子机制。我们发现在b End3细胞中CRHR1激动剂CRH可以逆转S1PR2拮抗剂JTE013对于过氧化氢诱导的脑血管内皮细胞高通透性和cPLA2磷酸化的抑制作用;而在小鼠p MCAO的模型中CRH可以逆转JTE013降低损伤侧EBD外渗的作用,并且对抗JTE013对于永久性脑缺血引起的脑水肿、神经细胞损伤和神经功能缺陷的保护作用。这些实验结果说明CRHR1介导了氧化应激条件下S1PR2的激活增加脑血管内皮细胞通透性的作用。