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与脊椎动物相比,无脊椎动物的免疫系统相对更为简单,缺少传统意义上的获得性免疫系统。免疫反应的开启是通过模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)识别病原物的病原相关分子(pathogen-associated molecule patterns, PAMPs),启动免疫反应。无脊椎动物中有许多模式识别受体,其中C-型凝集素就属于一大类蛋白家族。本研究组在前期工作中通过对棉铃虫免疫刺激后的脂肪体组织进行转录组测序,找到了六种C型凝集素序列。我们挑选其中的两个基因HaCTL3和HaCTL7来进行研究。我们对HaCTL3和HaCTL7,及HaCTL7N端CRD (HaCTL7D1)和C端CRD (HaCTL7D2)进行了原核表达、纯化。获得重组蛋白后,我们对蛋白的体外(细菌凝集,包囊)和体内(黑化)活性进行了一系列的研究分析。具体结果如下：1.棉铃虫C-型凝集素HaCTL3原核表达、纯化与功能研究我们从棉铃虫脂肪体中克隆得到一种新型的C-型凝集素HaCTL3。HaCTL3、表达载体pET-32a (+)同时用EcoRI和Xho I进行双酶切,连接、转化、筛选、测序验证后成功得到阳性克隆。并在IPTG的诱导下成功表达出重组蛋白rHaCTL3,将细胞破碎后取沉淀经变性复性后,过Ni纯化柱得到可溶且具有生物活性的重组蛋白。其大小在50kDa左右。将重组蛋白进行了凝集、包囊和黑化等试验。结果发现重组蛋白rHaCTL3对实验中的三种革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、微杆菌、生淀粉糖化酶菌)和四种革兰氏阴性菌(大肠杆菌、反消化细菌、放射型根瘤菌、弧菌)均具有凝集活性,并且活性依赖于Ca2+的存在。其中rHaCTL3对大肠杆菌的凝集活性最为明显。rHaCTL3的凝集活性对Ca2+的最小依赖浓度相差不大。体外糖抑制实验还发现rHaCTL3主要受到Mal、LPS、PGN抑制。推测其对Mal等相关糖的一类病原物能进行特异性地识别。蛋白体外和凝胶珠孵育后,可促进血细胞对凝胶珠的包被。同时还发现,重组蛋白与凝胶珠孵育后可以促进对凝胶珠的黑化作用,暗示rHaCTL3在激活酚氧化酶级联反应过程起作用。2.棉铃虫C-型凝集素HaCTL7及其糖识别结构域HaCTL7D1、HaCTL7D2原核表达、纯化与功能研究同上述HaCTL3类似,首先通过基因克隆分别得到HaCTL7成熟肽序列和单结构域HaCTL7D1、HaCTL7D2基因。用EcoR I和Xho I对三部分基因片段和表达载体pET-32a同时双酶切,同样构建好三种重组表达质粒并分别转化表达菌株,IPTG诱导得到重组蛋白rHaCTL7、rHaCTL7D1、rHaCTL7D2,其分子量分别为46kDa、28kDa、30kDa。功能研究发现,rHaCTL7和rHaCTL7D2在Ca2+存在下,能对实验中三种革兰氏阳性菌和四种阴性菌产生凝集,且它们的凝集能力相比较rHaCTL3更为显著,对各种细菌的最小凝集浓度更低。且rHaCTL7和rHaCTL7D2对各种细菌的凝集能力相当,无明显差异。它们对Ca2+的依赖程度和rHaCTL3相近。除凝集作用外,rHaCTL7和rHaCTL7D2还可以参与细胞反应如包囊,通过实验组中重组蛋白和凝胶珠孵育后,能明显增强血细胞对凝胶珠的包被作用。同时rHaCTL7和rHaCTL7D2也增强了对凝胶珠的黑化作用,暗示它们参与了酚氧化酶的激活。N端的糖识别结构域rHaCTL7D1的功能分析表明,rHaCTL7D1既不参与对细菌的凝集,也没有促进血细胞对凝胶珠的包被和黑化,暗示它可能在其它的免疫过程中发挥作用。结果表明,rHaCTL3、rHaCTL7均能作为一种模式识别受体参与识别某些普遍的病原物,通过促进血细胞对病原体包被以及激活酚氧化酶系统,促进对病原物的黑化,从而抵御外来微生物的入侵。并且,HaCTL7的这些功能主要归功于其羧基端的糖识别结构域。本研究丰富了无脊椎动物,尤其是棉铃虫中C型凝集素的研究,为害虫控制提供了潜在的可资利用的分子靶标。