组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)是近十年来美国食品与药品管理局唯一批准的用于急性缺血性脑中风后进行溶栓治疗的药物(NIH study，NEJM Dec1995)。然而，tPA应用后只有30％的急性中风病人可以完全或近完全恢复，而脑出血并发症的发生率却增加了10倍。越来越多的研究表明，在缺血后脑组织中内源性tPA活性增加，具有一些神经血管毒性作用，这与它的溶栓作用无关，而可能是tPA作为细胞因子在发挥作用。更重要的是，虽然tPA在血管内是有益的(溶栓)，并且是纤维蛋白溶酶原介导的，但是大部分存在于缺血脑组织的tPA是有害的，并且不是通过纤溶酶原介导的。 低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP1)是一个内吞受体，被发现存在中枢神经系统(CNS)的神经元和血管周围星形胶质细胞。LRP1与多个配体包括tPA发生作用。tPA在中枢神经系统的大部分功能是LRP1介导的。 神经血管单元(NVU)是随着研究的深入而提出的一个更为合理的概念。大脑是一个整体的功能单位，在缺血性卒中发生时，神经元、神经胶质细胞及微血管均受到损害，通过单一的分子机制进行调控，结果往往不理想。在过去的50多年中，绝大部分神经保护剂往往动物实验有效而临床试验无效，正说明了这一点。神经血管单元包括血管内皮细胞、基底膜、管周细胞、胶质细胞和神经元。NVU的主要功能是调节物质从血管内进入脑组织的通透性。其发挥作用的一个重要结构是星形胶质细胞终足与与管周基膜所形成的屏障结构。脑缺血后，NVU通透性增加，导致了脑水肿和脑出血的形成，这是急性脑中风病人的两大重要死因。越来越多的研究表明，tPA对NVU通透性有直接的影响。 蛋白激酶B(PKB，又叫Akt蛋白)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，有研究表明它在脑缺血后神经细胞存活方面发挥了重要的作用。我们的研究发现，脑缺血不仅引起神经元内Akt磷酸化增加(与神经元存活有关)，在管周星形胶质细胞中也有增加(可导致NVU通透性增加)。更重要的是，我们的研究表明，tPA与LRP在星型角质细胞及基底膜表面的相互作用导致pAkt表达增加，并引起NVU通透性增加。 这里我们利用免疫印迹和免疫荧光分析，发现在脑缺血早期，与tPA基因敲除小鼠相比，野生型小鼠pAkt表达明显增加。我们进一步的研究表明，向tPA基因敲除小鼠脑内注射tPA，可以诱导Akt的磷酸化水平达到野生型小鼠脑缺血后Akt的磷酸化水平，表明tPA介导了脑缺血早期pAkt表达水平的增高。这些结果表明内源性tPA与脑缺血早期磷酸化Akt(pAkt)的表达增加有关。 我们发现，pAkt在缺血脑组织的表达具有细胞及时间选择性。在野生型小鼠，pAkt主要在缺血早期星形胶质细胞中表达。在tPA基因敲除小鼠，pAkt在神经元持续表达(6~24小时)。在以往的研究中，在脑缺血后缺血组织Akt磷酸化水平升高，被认为具有神经保护作用。为了明确是否pAkt在神经元中的表达增加对细胞凋亡有影响，我们利用免疫印迹法比较了野生型及tPA基因敲除小鼠PARP-1的表达的差异，以及利用TUNEL法比较调往细胞的多少。我们的结果显示神经元表达的pAkt具有神经保护作用。 关于P-Akt在星形胶质细胞中的作用研究较少。以往的研究表明，PI-3K-Akt/PKB信号转导通路介导了脑缺血后血管内皮生长因子(VEGF)引起的神经元保护作用和血脑屏障通透性增加的作用。另外也有研究表明星形胶质细胞在调节血脑屏障通透性方面有重要作用。因此我们推测tPA介导的星形胶质细胞pAkt表达增加与脑缺血后NVU通透性增加有关。我们给大脑中动脉阻断的野生型小鼠脑室内注射Wortmannin，一种特异性磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3K)的抑制剂，可以阻断PI-3K-Akt/PKB信号转导通路。6小时后检查伊文斯蓝外渗率，这是检测血脑屏障通透性的常用指标。我们发现，与对照组相比，Wortmannin处理组小鼠伊文斯蓝渗透率降低了57+/-18％。 纤维蛋白溶酶原是tPA最常见的底物，所以我们进行免疫印迹试验，来观察tPA对pAkt的作用是否具有纤溶酶原(plasminogen)依赖性。我们的研究结果表明，pAkt表达水平在纤溶酶原基因敲除小鼠和野生型小鼠并无区别，这表明tPA对pAkt的影响并不是通过纤溶酶原机制来发挥的。 我们对大脑中动脉阻塞1小时后野生型小鼠和tPA基因敲除小鼠的脑组织提取物进行了免疫共沉淀的研究。结果表明，与野生型小鼠相比，tPA基因敲除小鼠及注射了受体相关蛋白(RAP，一种对LRP1具有阻断作用的蛋白质)的野生型小鼠，脑缺血引起的LRP1与pAkt相互作用明显减少。我们的电子显微镜共定位研究显示LRP1胞内段(LRP-ICD)和pAkt共同存在于NVU的每一个兴趣区域的周围星形胶质细胞中。总之，这些结果表明，在脑缺血的早期阶段，在血管周围的星形胶质细胞中tPA与LRP1的相互作用诱导Akt蛋白磷酸化。 NF-κB是pAkt的下游蛋白之一，所以我们进一步研究了在星形胶质细胞中Akt蛋白磷酸化是否介导tPA对NF-κB的活化。将培养的野生型星形胶质细胞分两组，均暴露于氧糖缺失(OGD)状态，一组培养液中之加入tPA，另一组加入tPA及pAkt通路阻断剂wortmannin，然后通过免疫印迹分析p65的磷酸化水平，这是显示NF-κB活化水平的常用指标。我们的研究结果表明，在星形胶质细胞中tPA诱导了p65的磷酸化水平，而在星形胶质细胞中同时加入tPA和wortmannin，这一作用被明显抑制。总之，结果支持我们的假设，即pAkt介导了tPA对NF-κB活化。 由于MMP-9是NF-κB的调节基因，所以我们进一步研究了tPA-LRP1-pAkt通路引起血脑屏障通透性增加与MMP-9的关系。我们利用明胶酶谱法测定wortmannin处理组及非处理组野生型小鼠缺血脑组织提取物中MMP-9活性。结果表明Wortmannin抑制pAkt表达后，缺血脑组织中MMP-9的活性明显降低。 总之，这些结果表明，在脑缺血早期tPA和LRP1在NVU的星形胶质细胞中的相互作用诱导激活pAkt介导的细胞信号通路，引起星形胶质细胞终足与管周基膜分离，最终导致血脑屏障通透性的增加。