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MicroRNAs简称miRNAs,是生物体内的一组具有高度保守性的非编码RNA。研究发现MicroRNAs可以调控细胞的增殖、分化、凋亡等生命现象,亦是迄今为止最重要的心血管生理功能调控分子。细胞自噬(autophagy)是生命体普遍存在的一种代谢途径,是一种高度保守的分解代谢过程,通过自噬溶酶体途径清除受损细胞器和蛋白聚集物,并将其产物循环利用来维持细胞内的稳态。已有研究指出细胞自噬可调节运动性心肌肥大。运动性心肌肥大是心肌细胞及其间质细胞受机械牵张或生长因子刺激后,心肌细胞内与细胞生长增殖有关基因的表达发生变化的一种运动引起的适应性反应。已有研究表明,miR-26b-5p在运动性心肌肥大的形成中扮演着重要角色,然而其具体调控机制尚不完善。研究目的:本研究旨在探讨miR-26b-5p在运动性心肌肥大中的表达情况及其调控作用,以及确定miR-26b-5p通过靶基因ULK1调控运动性心肌肥大的分子机制。研究方法:选取24只6周龄清洁级雌性Wistar大鼠,随机分成安静对照组(CON,n=12)、运动性心肌肥大模型组(EX,n=12)。安静组大鼠普通笼内饲养,不进行任何运动。模型组大鼠参照Fernandes的运动方案制定10周游泳运动训练,建立运动性心肌肥大动物模型,采用超声检查、全心指数(全心重/体重,HW/BW)、左室指数(左心室重/体重,LW/BW),HE染色观察心肌细胞形态,并结合检测大鼠心肌病理性标志物的表达情况,综合评价运动性心脏肥大动物模型建立情况。通过生物芯片技术和RT-qPCR检测大鼠心肌内miR-26b-5p表达水平的变化。同时,采用透射电镜、LC3B和Beclin1的表达水平反映运动性心肌肥大模型中大鼠心肌自噬水平的变化。用生物信息学预测miR-26b-5p的靶基因,在体外过表达及干扰表达miR-26b-5p后通过Western Blot和RT-qPCR检测其预测靶基因ULK1的表达,并用免疫荧光实验检测LC3B的变化,反映自噬的变化。最后用双荧光素酶报告基因验证靶向关系。从而证明miR-26b-5p在运动性心肌肥大中的表达情况及其调控作用。研究结果:1.运动性心肌肥大动物模型的建立与评价:大鼠10周的游泳运动后,与对照组大鼠相比,模型组大鼠全心指数显著升高(p<0.05),左室指数显著增加(P<0.01),HE染色结果表明,模型组大鼠心肌细胞心肌体积增大,结构正常,细胞核卵圆形,大小分布均匀,出现了一定程度的胶原纤维增生现象,心肌细胞直径显著增加(p<0.05)。大鼠心动超声结果提示:与对照组大鼠相比,模型组大鼠心脏泵血功能明显增强。心肌肥大病理学指标检测结果显示,与对照组大鼠相比,模型组大鼠心肌内的ANP、α-actin的mRNA表达水平未发生显著的变化(p>0.05,p>0.05),且α-MHC/β-MHC的比值未发生显著改变(p>0.05)。因此,在本次建模过程中,10周游泳运动大鼠心脏发生肥大性改变,且左心室肥大较为明显,但并未引发大鼠心脏的病理性改变,这表明运动性心肌肥大动物模型成功建立。2.运动性心肌肥大动物模型中miRNA的变化:通过miRNA生物芯片发现,miR-26b-5p表达量显著下降(p<0.01)。同时RT-qPCR结果表明:与对照组相比,模型组大鼠心肌miR-26b-5p表达水平显著降低(p<0.01)。3.运动性心肌肥大动物模型中心肌自噬水平的变化:10周的游泳运动后,与对照组的大鼠相比,模型组的大鼠的心肌组织中的LC3ⅡmRNA和蛋白表达水平,以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均显著升高(p<0.01,p<0.01,p<0.01),模型组大鼠的心肌组织中的Beclin1 mRNA、蛋白表达水平也显著上升(p<0.01,p<0.01)。透射电镜观察发现:与对照组大鼠相比,模型组大鼠心肌组织自噬小体数量明显增多,这表明:通过10周游泳运动,运动性心肌肥大模型中的大鼠心肌自噬水平升高。4.生物信息学预测结果:通过miRNA靶点的生物信息学预测发现,在大鼠ULK1的基因序列中,编码区第1019-1026及1120-1127碱基的位置序列(tacttgaa)是miR-26b-5p的结合位点。5.miR-26b-5p通过靶向ULK1调控运动性心肌肥大:(1)检测大鼠心肌组织中ULK1蛋白和mRNA表达水平变化发现:与对照组大鼠相比,模型组大鼠心肌中ULK1蛋白和mRNA表达水平显著上升(p<0.01,p<0.01);(2)与空载病毒感染组相比,过表达miR-26b-5p的心肌细胞ULK1 mRNA和蛋白的水平显著降低(p<0.01,p<0.01),同时免疫荧光结果显示LC3B表达下调,心肌自噬减弱;干扰表达miR-26b-5p的心肌细胞ULK1 mRNA和蛋白的水平显著升高(p<0.01,p<0.01),免疫荧光结果显示LC3B表达同时发生了上调,自噬增强。6.双荧光素酶报告基因实验结果表明:共转染ULK1-WT 3’UTR和miR-26b-5p mimics后,相对荧光素酶活性显著低于mimics-NC组;与之相反,共转染ULK1-WT 3’UTR和miR-26b-5p inhibitor后,相对荧光素酶活性显著高于inhibitor-NC组,而两组分别与ULK1-MT1+MT2 3’UTR共转染后,与NC组无差异。综上所述,ULK1是miR-26b-5p的靶基因,miR-26b-5p可通过自噬相关基因ULK1调控运动性心肌肥大。研究结论:1.10周的游泳运动成功构建了运动性心脏肥大动物模型。2.运动性心肌肥大大鼠模型中,心肌自噬水平显著增加。3.运动性心肌肥大发生是miRNA靶向作用于自噬相关基因的结果,其机制可能是:运动可下调心肌miR-26b-5p的表达水平,miR-26b-5p通过靶向作用于ULK1(结合位点为ULK1的1019-1026及1120-1127碱基的位置序列(tacttgaa)),使其表达水平上调,进而促进心肌自噬的水平提高,最终引发运动性心肌肥大。