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目的:卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官三大恶性肿瘤之一,其早期诊断率低,中晚期转移率高,预后较差。对于卵巢癌发病机理的研究仍有许多问题有待于解决。近年来越来越多的证据表明,卵巢癌的发生和进展与其所处的激素环境有关。绝经,排卵多或不孕治疗时过量卵泡刺激素(FSH)刺激可能是卵巢癌发生的重要危险因素。多项研究显示FSH作用于细胞表面FSH受体激活胞内信号传导通路发挥作用,而其具体作用机制尚不清楚。磷脂酞肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号传导通路在肿瘤的发生、发展、凋亡、血管生成、转移及耐药等方面起着重要的作用。可被PI3K/AKT通路直接或间接影响的下游分子主要包括细胞增殖和蛋白合成的相关因子和一些凋亡相关因子。核转录因子(NF-κB)作为信号传导通路的中枢,是AKT重要的下游分子之一,其异常活化可调节与细胞增殖和凋亡有关的基因转录,溶解细胞外间质促进肿瘤细胞的浸润和转移。因此,本实验主要研究FSH通过PI3K/AKT途径作用于NF-κB,并调节其表达,使卵巢上皮性癌细胞发生增殖和侵袭的机制,以及阻断该通路对卵巢癌恶性进展的影响,拟为卵巢癌的发病机制和基因治疗提供新的实验依据。方法:将SKOV-3、3AO细胞置于37℃,饱和湿度5%CO2的RPMI-1640培养基中常规培养,待细胞进入对数生长期后用于实验。1光镜观察:将不同浓度的FSH和PI3K/AKT抑制剂LY294002作用于SKOV-3、3AO细胞,在倒置相差显微镜下定时观察细胞的生长情况并照相。2 MTT法:调整细胞浓度为1×105/ml,以每孔100μl培养于96孔培养板中,待细胞进入对数生长期后,用不同浓度FSH(10、20、40、80、160mIU/ml)作用不同时间(12h、24h、48h、72h),采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测药物对细胞的生长促进作用及分析其与时间和浓度之间的关系。3 Western blot蛋白印迹法:观察FSH和LY294002分别及序贯联合作用于SKOV-3、3AO细胞前后FSHR、AKT1/2、p-AKT、NF-kappaB蛋白的表达,以及细胞核与细胞浆中NF-κB蛋白的表达差异。4 Transwell小室侵袭实验:调整细胞浓度为1×105/ml,每孔上层小室中加200μl细胞悬液,24孔板槽中加入500μl含10%胎牛血清的培养基。待细胞贴壁后,用FSH 40mIU/ml和LY294002 10μmol/L分别及序贯联合作用于细胞,48小时后结晶紫染色,显微镜下观察上层小室底部穿过的细胞情况并计数。5应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。结果:1倒置相差显微镜下观察可见经FSH作用SKOV-3、3AO细胞后,随时间延长,浓度增加,细胞形态稍变长,生长速度和密集度明显增加。经LY294002作用30分钟后加入FSH继续作用,细胞形态变化不大,增长速度和密集度减低。单独LY294002作用后部分细胞形状由梭形变为圆形,然后细胞开始皱缩,细胞增长能力减弱。2不同浓度FSH(10、20、40、80、160mIU/ml)作用不同时间(12h、24h、48h、72h),MTT结果显示SKOV-3细胞于FSH 40mIU/ml作用48 h时细胞增长最快,浓度与其他组比较有显著差异(P<0.05),而时间点之间相比则无差异(P>0.05)。3AO于FSH 40mIU/ml作用24h时细胞增长最快,与其他浓度和时间点进行统计学比较均有显著差异(P<0.05)。3 Western bloting结果:①SKOV-3、3AO细胞中FSHR蛋白均有表达,FSH和LY294002单独及联合处理后细胞表达与对照组相比无差异(P>0.05)。②SKOV-3细胞经FSH及LY294002单独处理与对照组相比分别表现为前者p-AKT蛋白表达增加,后者表达则减少(P<0.05),FSH/LY294002联合处理与对照组比较表达减少(P<0.05),而AKT1/2蛋白表达四组间均无差异(P>0.05)。NF-κB总蛋白在三个实验组中表达与对照组相比均无统计学意义(P>0.05);但FSH组表达明显多于LY294002组(P<0.05)。胞核中NF-κB蛋白表达FSH组与对照组相比表达增加(P<0.05),而LY294002组及FSH/LY294002组表达减少(P>0.05);且FSH组表达明显多于LY294002组、FSH/LY294002组(P<0.05),而后两者比较无差异(P>0.05)。胞浆中NF-κB蛋白三个实验组与对照组相比表达均增加,但无统计学差异(P>0.05)。对对照组、FSH组、FSH/LY294002组及LY294002组各组中胞核与胞浆的比值进行统计学分析,四组间有显著差异(P<0.05)。其中,FSH组明显大于FSH/LY294002组及LY294002组,LY294002组明显小于对照组和FSH组(P<0.05),而其他组间比较无差异(P>0.05)。③3AO细胞中p-AKT蛋白表达,三个实验组与对照组比较均有统计学差异(P<0.05)。其中,FSH组p-AKT蛋白表达明显多于其余三组(P<0.05);LY294002组、FSH/LY294002组中表达明显少于对照组(P<0.05)。四组之间AKT1/2蛋白表达均无差异(P>0.05)。总提取蛋白中NF-κB蛋白表达FSH组明显少于对照组及LY294002组(P<0.05),而四组之间及其他组间比较无明显差异(P>0.05)。胞核中NF-κB蛋白表达四组之间比较有明显差异(P<0.05),其中,FSH组与其他三组相比表达明显增加(P<0.05);而LY294002组,FSH/LY294002组与对照组比较表达减少,但无统计学差异(P>0.05),且其两组间比较亦无差异(P>0.05);胞浆中NF-κB蛋白表达FSH组多于对照组及LY294002组、FSH/LY294002组,但组组间比较无统计学差异(P>0.05)。对对照组、FSH组、FSH/LY294002组及LY294002组各组中胞核与胞浆的比值进行统计学分析,四组间有显著差异(P<0.05)。其中,FSH组明显大于其余三组(P<0.05),FSH/LY294002组明显大于对照组(P<0.05),而FSH/LY294002组与LY294002组比较无差异(P>0.05)。4 Transwell小室侵袭结果:经FSH处理的两种细胞穿过小室的细胞数明显多于对照组(P<0.05);经LY294002单独处理组及两者联合作用组的两种细胞穿过小室的细胞数均明显少于FSH组(P<0.05),但两组相比无明显差异(P>0.05)。结论:1卵泡刺激素有促进上皮性卵巢癌细胞株SKOV-3、3AO增殖作用,提示增殖峰最高时的浓度可能是最强作用浓度。2 SKOV-3、3AO细胞中均存在FSHR受体,卵泡刺激素作用于细胞SKOV-3、3AO后激活PI3K/Akt途径,提高了p-AKT蛋白的表达量,进而诱导其下游分子NF-κB蛋白在细胞核中表达增加,促进细胞增殖,增加肿瘤细胞侵袭能力。3 PI3K/Akt抑制剂LY294002作用于SKOV-3、3AO细胞后再给予FSH刺激,p-AKT活性被抑制,蛋白表达明显降低,进而NF-κB蛋白在细胞核中表达降低,抑制细胞增殖,降低肿瘤细胞侵袭能力。4卵泡刺激素可能是通过PI3K/Akt通路促进卵巢癌细胞株SKOV-3、3AO中NF-κB的表达,实现对卵巢癌细胞的促增殖和侵袭作用。