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研究一 热量限制治疗2型糖尿病作用机制的代谢组学研究目的:研究2型糖尿病(T2DM)患者在给予极低热量限制(VLCR)治疗前后一般糖脂代谢指标、安全指标以及血浆代谢组的变化,筛选出VLCR干预后引起糖尿病患者血浆代谢组变化的特异性生物标记物,从代谢组学角度阐述短期VLCR改善T2DM患者糖脂代谢的作用机制。方法:选择符合纳入标准的T2DM住院患者10名,予9天的VLCR,收集患者VLCR前和VLCR后的空腹血。检测其糖脂代谢指标与安全性指标,观察VLCR前后各项指标的变化。采用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-Q/TOF-MS/MS)技术采集10名糖尿病患者给予VLCR治疗前后的血浆代谢物谱数据。采用偏最小二乘方差分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘-判别分析(OPLS-DA)模型对治疗前后血浆代谢物进行对比分析。结果:T2DM患者VLCR后糖脂代谢得到改善、安全指标未有变化。运用多变量统计分析方法中的PLS-DA法可以成功区分T2DM患者VLCR前组与VLCR后组。运用多变量统计方法中的OPLS-DA法发现了5个潜在的生物标记物,溶血磷脂酰胆碱(16:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:2(9z,12z))、溶血磷脂酰胆碱(20:4(7z,8z,llz,14z))、戊酰肉碱、亮氨酸;并针对5个生物标记物对VLCR治疗可能的作用机制进行讨论。结论:VLCR可以改善T2DM患者的糖脂代谢,部分恢复胰岛功能,短期VLCR对T2DM患者来说是一种安全有效的方法。T2DM患者VLCR治疗前后血浆代谢物比较,差异有统计学意义。VLCR可以调节T2DM患者体内代谢紊乱,其作用机制可能与升高溶血磷脂酰胆碱(16:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:2(9z,12z))、溶血磷脂酰胆碱(20:4(7z,8z,11z,14z))、戊酰肉碱、亮氨酸有关。研究二热量限制逆转高脂诱导的胰岛P细胞凋亡和去分化目的:探讨热量限制(CR)对棕榈酸(PA)诱导的小鼠胰岛素瘤MIN6细胞凋亡和去分化的影响,并探讨其可能的分子机制。方法:用不同浓度的PA(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mmol/L)干预MIN6细胞24h后,噻唑蓝法(MTT)检测PA对MIN6细胞增殖的抑制作用。将MIN6细胞分为四组:正常培养组、Earle’s平衡盐溶液(EBSS)组(模拟体外CR)、棕榈酸(PA)组、PA联合EBSS组。干预5小时后,倒置显微镜观察MIN6细胞形态,MTT检测细胞增殖;蛋白质印迹法(WB)检测促调亡蛋白(Bax)、抗凋亡蛋白(Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase3)以及AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)蛋白磷酸化水平和沉默信息调节因子相关酶l(SIRTl)蛋白的表达水平;荧光定量(qPCR)检测胰岛功能相关基因:胰岛素(Insulin)、葡萄糖转运蛋白2(Glut2)、胰十二指肠同源盒(Pdxl)、肌腱鞘纤维肉瘤癌基因同系物A(Ma￡\)、同源域转录因子NK6同源盒1(Nkx-6.1)、神经细胞分化因子1(NeuroDl)、叉头转录因子1(FOXOl)mRNA表达水平。结果:MTT结果显示:随着PA浓度的升高,对MIN6细胞增殖的抑制作用越来越强,细胞活力逐渐降低,且呈浓度依赖性。倒置显微镜下观察细胞形态,与正常对照组相比,PA组细胞密度系数降低,贴壁细胞数量减少,细胞形状由梭形变为碎片、颗粒,PA+EBSS组与PA组相比,细胞密度系数增高,贴壁细胞数量增多,细胞形态趋于正常,细胞碎片、颗粒减少;MTT分析示,与PA组相比,PA+EBSS可以改善PA对细胞增殖的抑制作用,提高细胞活力(P<〇.〇5);Western Blot结果显示:PA导致Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低,Bax/Bcl-2比值升高、Cleaved Caspase3蛋白表达升高,PA+EBSS联合千预后,Bax蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高,Bax/Bcl-2比值降低、Cleaved Caspase3蛋白表达降低(P<0.05);同时,与PA组相比,PA+EBSS组AMPK蛋白磷酸化水平和SIRT1蛋白表达水平均显著上调(P<0.05);qPCR结果显示:与对照组相比,PA导致Pdxl、MafA、FOXOl、Glut2 mRNA表达降低,差异有统计学意义(P<0.05),Insulin、NeuroDl、NKX6.1 mRNA表达无变化,PA+EBSS联合干预后,Pdxl、MafA mRNA表达升高,差异无统计学意义(P>0.05),Insulin、NKX6.1、NeuroDl、FOXOl mRNA表达显著升高,Glut2 mRNA的表达显著降低(P<〇.〇5)。结论:(1)PA可呈剂量依赖性的抑制MIN6细胞的生长、促进细胞凋亡,诱导胰岛p细胞发生去分化。(2)CR能促进细胞生长、抑制PA诱导的MIN6细胞的凋亡与去分化,此过程的分子机制可能与激活AMPK-SIRT1通路有关。