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研究目的1.探讨miR-139-5p在肝癌有氧糖酵解和增殖中的作用;2.探讨miR-139-5p调控肝癌有氧糖酵解和增殖的分子机制。研究内容和方法1.miR-139-5p对肝癌细胞有氧糖酵解和增殖的影响。1)利用慢病毒和mimics转染肝癌细胞株SK-Hep-1和SMMC-7721使其过表达 miR-139-5p;2)过表达miR-139-5p后,检测培养基中葡萄糖消耗和乳酸产生以观察有氧糖酵解活性,RT-PCR和Western blot检测糖酵解相关基因表达;3)过表达miR-139-5p后,CCK-8及裸鼠皮下成瘤检测细胞增殖。2.miR-139-5p调控肝癌细胞有氧糖酵解和增殖的分子机制。1)过表达miR-139-5p后,RT-PCR和Western blot检测转录因子表达;2)利用双荧光素酶实验鉴定miR-139-5p直接作用的转录因子即靶基因;3)RT-PCR 和 Western blot 检测 miR-139-5p 的靶基因 ETS1 是否调控HK1,PFKFB3 的表达;4)利用 RT-PCR 和 Western blot 进行 ETS1 的 rescue 实验;5)ChIP和双荧光素酶实验探寻ETS1对HK1,PFKFB3的调控机制;6)RT-PCR,Western blot,ChIP和双荧光素酶实验探寻ETS1对miR-139-5p的调控和机制。3.miR-139-5p和ETS1在肝癌组织中的表达特性。1)RT-PCR检测miR-139-5p在肝癌组织中的表达,利用TCGA和GEO数据集分析miR-139-5p在肝癌组织中的表达及与肝癌病人预后关系;2)RT-PCR检测ETS1在肝癌组织中的表达及与miR-139-5p相关性。结果1.miR-139-5p抑制肝癌细胞有氧糖酵解和增殖。1)与scramble相比,过表达miR-139-5p后肝癌细胞株SK-Hep-1和SMMC-7721糖酵解活性减弱,HK1和PFKFB3表达下调;2)与scramble相比,过表达miR-139-5p后肝癌细胞增殖受抑制。2.miR-139-5p直接靶向ETS1下调其表达,进而抑制了 ETS1的靶基因HK1和PFKFB3;同时ETS1还通过Drosha依赖的方式反过来下调miR-139-5p表达。1)miR-139-5p可以下调ETS1 mRNA和蛋白水平,双荧光素酶实验表明miR-139-5p可以直接靶向ETS1;2)RT-PCR和Western blot结果表明ETS1可以促进HK1和PFKFB3的表达,同时过表达ETS1可以逆转miR-139-5p导致的HK1和PFKFB3表达的下调,ChIP和双荧光素酶实验进一步表明ETS1直接结合到HK1和PFKFB3启动子区域并促进其表达;3)ETS1还可以下调miR-139-5p,但不影响Pri-miR-139和PDE2A的表达,提示ETS1是在转录后水平调控miR-139-5p,RT-PCR和Western blot结果表明ETS1是通过Drosha依赖的方式来调控miR-139-5p的表达,ETS1可以直接结合到Drosha启动子区域进而下调其表达。3.miR-139-5p在肝癌组织中低表达,TCGA数据集分析结果表明miR-139-5p低表达与肝癌患者不良预后相关;ETS1在肝癌组织中高表达且与miR-139-5p表达呈负相关。结论miR-139-5p抑制肝癌细胞有氧糖酵解和增殖,可以下调HK1和PFKFB3的表达;机制上,miR-139-5p直接靶向ETS1下调其表达,进而抑制了 ETS1的靶基因HK1和PFKFB3,ETS1可以直接结合到HK1和PFKFB3启动子区域从而促进其表达;同时ETS1还可以直接结合到Drosha启动子区域下调Drosha表达,从而通过Drosha依赖的方式抑制miR-139-5p;miR-139-5p在肝癌组织中低表达且miR-139-5p的低表达与肝癌病人不良预后相关;ETS1在肝癌组织中高表达,其表达与miR-139-5p负相关。