目的:(1)建立简便、易行的胚胎小鼠神经干细胞体外分离培养的方法。(2)建立神经干细胞快速诱导分化方法,鉴定诱导分化后的细胞类型。(3)检测神经干细胞体外增殖及向神经元定向分化过程中DNA拓扑异构酶Ⅱ的表达情况。　　 方法:　　 1.神经干细胞的分离培养　　 取ICR小鼠(E12.5d)大脑皮质部分,用Acutase消化,制成单细胞悬液,接种于无血清培养基(含B27和20ng/ml bFGF,20ng/ml EGF的DMEM/F12培养基)中,观察神经干细胞的体外生长过程。　　 2.神经干细胞的鉴定　　 2.1 nestin免疫细胞化学:取来自神经球的冰冻切片做nestin免疫细胞化学,一抗为兔抗nestin单克隆抗体(1:100),鼠抗ki67抗体(1:100),4℃,24h;二抗为DyLightTM594标记山羊抗兔IgG,DyLightTM488标记山羊抗小鼠IgG,含有DAPI,37℃,避光,1h。荧光显微镜下观察结果,采集图像。　　 2.2 生长曲线绘制(CCK8法):取传至第3代的神经干细胞,向96孔板中每孔加入100μl细胞悬液,含1000个细胞,37℃,预孵育。从第二天开始,每天任意取5孔,加入10μlCCK8溶液,37℃,孵育2h；在酶标仪上测定光吸收值,用所测数值描绘细胞的生长曲线。　　 2.3 分化潜能:收集神经球接种于PLL包被的盖玻片上,加入条件培养液(含B27,N2,10ng/ml GDNF的DMEM/F12培养基),在培养后3d分别做GFAP和NSE免疫细胞化学来检测分化细胞的类型。　　 3.神经干细胞快速诱导分化及TopoⅡ的表达检测:将神经球消化成单细胞后,接种于用Matrigel铺底的盖玻片上,培养液中加入含B27,N2,10ng/mlGDNF的DMEM/F12条件培养基。37℃,5％CO2饱和湿度培养箱内培养3d后,用免疫细胞化学、免疫印迹、定量PCR检测TopoⅡ的表达。　　 4.结果分析　　 用单因素方差分析(ANOVA)比较每种蛋白阳性细胞率在各组间的差异。如果方差齐,用LSD法进行两两比较；如果方差不齐,用Games-Howel法进行两两比较。　　 结果:　　 1.体外培养的神经干细胞聚合成神经球,悬浮生长。神经球外围分布有一层大小较均匀,折光性好的细胞。　　 2.所培养细胞呈nestin阳性,ki67阳性,细胞倍增时间为2d,提示具有增殖能力。诱导分化后,可见GFAP和NSE阳性细胞,提示其具有多向分化潜能。所培养细胞是神经干细胞。　　 3.神经干细胞快速诱导分化。倒置显微镜观察,诱导后1d,贴壁细胞突起生长旺盛,交织成网,可以观察到两种形态的细胞:一种具备成熟胶质细胞的特征,伸出长而粗的突起,交织成网；另一种为胞体呈多边形、具有数个细长突起的具备神经元形态特征的细胞。诱导后2d,具有神经元形态特征的细胞突起进一步生长,交织；胶质细胞数量下降,突起变得不明显。诱导后3d,部分胶质细胞出现死亡,具有神经元形态特征的细胞仍可见较长的突起,基本形态仍存在。　　 4.免疫细胞化学检测快速诱导分化后的细胞类型　　 Nestin免疫荧光显示:神经球中nestin阳性细胞分布均匀,数量较多。nestin阳性细胞在诱导分化1d后有所减少,2d后明显减少,3d几乎看不到。统计学结果表明,各组之间的nestin阳性细胞率的差异有统计学意义(p<0.05),并且各组之间两两比较均有差异(p<0.05)。　　 MAP2免疫荧光显示:神经球中央存在少量MAP2阳性细胞。MAP2阳性细胞在诱导分化1d后逐渐增多；2d时明显增多；3d时数量较2d稍多。统计学结果表明,各组之间的MAP2阳性细胞率的差异有统计学意义(p<0.05),两两比较表明,2d组和3d组之间的差异无统计学意义(p>0.05),其他各组之间的差异均有统计学意义(p<0.05)。　　 GFAP免疫荧光显示:神经球中GFAP阳性细胞较多。GFAP阳性细胞在诱导分化1d后仍然很多；2d后逐渐减少；3d后继续减少。统计学结果表明,各组之间的GFAP阳性细胞率的差异有统计学意义(p<0.05),并且各组之间两两比较均有差异(p<0.05)。　　 5.免疫细胞化学检测神经干细胞分化过程中TopoⅡ的表达　　 ToooⅡα阳性细胞在神经球内数量较多,分布均匀。TopoⅡα阳性细胞在诱导分化后1d略有减少；诱导分化2d后显著减少；诱导分化3d后继续减少。统计学结果表明,各组之间的TopoⅡα阳性细胞率的差异有统计学意义(p<0.05),两两比较表明,神经球和1d组之间,2d组和3d组之间的差异无统计学意义(p>0.05),其他各组之间的差异均有统计学意义(p<0.05)。　　 神经球内强表达的TopoⅡβ阳性细胞较少,主要分布在神经球中央。TopoⅡβ阳性细胞在诱导分化1d后数量增多,TopoⅡβ表达也明显增强；诱导分化2d时强表达阳性细胞数量达到高峰；诱导分化3d时强表达阳性细胞数量下降。统计学结果表明,各组之间的TopoⅡβ阳性细胞率的差异有统计学意义(p<0.05),两两比较表明,1d组和3d组之间的差异无统计学意义(p>0.05),其他各组之间的差异均有统计学意义(p<0.05)。　　 共聚焦显微镜免疫荧光双标显示:分化细胞中,只有在突起较长的MAP2阳性细胞中,其胞核内TopoⅡβ才呈强阳性表达。　　 6.ToooⅡ mRNA和蛋白的表达　　 TopoⅡα mRNA的表达,在神经球中高；诱导分化1d时表达较高；2d时表达明显下降；3d～5d逐渐减低,维持在一较低水平。TopoⅡβ mRNA的表达,在神经球中低；诱导分化1d时缓慢增高,2d时达到高峰,3d～5d表达缓慢降低。　　 TopoⅡα蛋白的表达,在神经球中高,在诱导分化1～2d的细胞中仍然较高,在诱导分化3d～4d表达逐渐降低。TopoⅡβ蛋白的表达,在神经球中很低,在诱导分化1d的细胞中稍高,在诱导分化2d的细胞中显著增高达到高峰,在诱导分化3d～4d缓慢下降。　　 结论:培养细胞经鉴定为神经干细胞。本方法简单易行、快速、有效,可重复性强,可诱导神经干细胞向神经元快速分化。TopoⅡα蛋白和mRNA在处于增殖状态的神经干细胞中表达水平较高,分化细胞中表达下降。TopoⅡβ蛋白和mRNA在神经球中表达较低,在诱导其向神经元定向分化过程中表达显著增高,在成熟神经元中表达缓慢下降,提示TopoⅡβ参与神经干细胞向神经元的定向分化。