研究背景和目的:目前我国高血压患者约占全球高血压总人数的1/5,至少有2.7亿人,且高血压导致死亡的人数每年高达150万,是国人健康的“无形杀手”。彻底阐明高血压的发病机制,对早期预防、及时治疗高血压及其并发症有极其重要的意义。高血压前期指从正常血压值向高血压过渡的阶段,也就是收缩压120~139 mm Hg和(或)舒张压80~89 mm Hg的阶段。我国人群高血压前期的发生率高达38.9%~41.3%,且为数众多的高血压前期人群是高血压病人的最主要来源;因此,如能对高血压前期人群采取有效的干预措施,将有助于降低高血压的发病率、减小高血压的治疗成本,并减轻高血压患者的痛苦、获得更好的疗效和预后,是一项有战略意义的疾病预防策略。机体的胰岛素信号异常与高血压的发生发展有密切关系,以往的研究主要集中探讨以高血糖、高胰岛素血症等表现为主的全身性胰岛素抵抗与高血压的关系,然而血管局部胰岛素敏感性在其中的作用尚不清楚。本课题利用幼年自发性高血压大鼠的研究结果表明,血管内皮的胰岛素信号通路受损致胰岛素诱导的血管舒张效应减弱,而此时血压尚未升高;提示血管的胰岛素抵抗虽不是全身代谢和血糖紊乱的直接原因,但由于心血管胰岛素敏感性下降发生于高血压形成之前,对维持血管张力、调节组织局部血流量、稳定动脉血压及血流动力学稳态等的具有重要意义。然而,血管胰岛素抵抗的上游诱发机制及其在高血压发生发展中的具体作用尚不清楚。脂联素是由脂肪细胞合成和分泌的细胞因子,具有调节代谢、抗炎及保护心血管系统等作用。临床研究证实低脂联素血症是高血压的独立危险因素,提示脂联素可作为人类易患高血压的预警分子。此外,我们前期发现,脂联素可通过抑制硝化/氧化应激保护高脂血症大鼠的血管内皮功能,提示脂联素水平降低与血管功能受损、动脉血压升高及高血压发病存在密切联系。然而,脂联素水平及生物效应的改变在高血压前期的变化趋势如何,对血管胰岛素敏感性和内皮功能是否有影响,这些问题尚未见报道。另一方面,运动被认为是治疗高血压的有效方法之一,其改善高血压的机制是多重的。重要的是,运动在高血压前期的作用及其机制尚不清楚。运动对全身胰岛素抵抗有明显的改善作用,其研究主要集中在运动对胰岛素代谢效应的调控方面。血管自身已发生的胰岛素敏感性降低及血管内皮功能失调,可导致外周血管阻力增加,后者可促使动脉血压升高甚或诱发高血压。然而,运动是否对血管胰岛素敏感性有影响,其机制是什么,尚不清楚。因此,本研究的目的是:阐明高血压前期的微动脉胰岛素抵抗的发生机制是否与低脂联素血症有关;在此基础上,揭示长期有氧运动是否能改善高血压前期的微动脉胰岛素敏感性,进而延缓动脉血压升高。研究方法:1.用Softron BP-98A大小鼠无创血压仪测量清醒、安静状态下的幼年及成年自发性高血压大鼠(SHRs)及其对照(WKY)大鼠尾动脉收缩压。取静脉血,测定全血血糖水平、血清胰岛素水平,并计算标志全身胰岛素抵抗的定量胰岛素敏感性检测指数(QUICKI)。采用ELISA试剂盒检测血清脂联素浓度。2.分离SHRs和WKY大鼠肠系膜微动脉,使用微血管灌流仪进行功能检测。实验前,动脉环静息负荷2 m N,稳定1 h。然后用60 mmol/L KCl溶液使血管收缩两次,取两次收缩张力大于l m N且收缩幅度相差<10%者用于实验。实验中,采用1μmol/L苯肾上腺素对血管进行预收缩处理,而后以浓度累加法加入舒张血管药物,根据血管的舒张程度来评定血管内皮的功能。3.大鼠长期有氧运动训练:运动组大鼠进行10 wk,60 min/d,5 d/wk的无负重游泳训练,游泳池规格是60×60 cm2的面积,水深50 cm,水温33-35℃。所有的运动训练均在每天的上午9:00-11:00进行。实验测定在最后一次运动训练后24 h后进行。4.信号分子表达和活性检测:提取总RNA,使用逆转录试剂盒和q PCR试剂盒通过实时定量PCR检测m RNA水平。提取组织蛋白,BCA法蛋白定量,利用待测分子的特异性抗体,Western blot检测蛋白表达或/及磷酸化水平的变化。5.采用NO检测试剂盒检测细胞培养液中NO的水平。采用ET-1检测试剂盒检测组织或细胞培养液中ET-1水平。6.培养的HUVECs,分别加入目的蛋白si RNA和阴性对照si RNA,利用Lipofectamine TM2000进行转染。转染5 h后换液,继续培养24 h、48 h或72 h,收集细胞提取蛋白。利用Western blot检测si RNA的转染效率并进行实验。实验结果:1.幼年(4周龄)自发性高血压大鼠(y SHRs)与年龄‐性别匹配的正常血压Wistar Kyoto大鼠(y WKY)相比,动脉血压、血糖水平与血浆胰岛素水平及QUICKI值没有差异。肠系膜微动脉对硝普钠和乙酰胆碱的舒张反应无明显差异。而y SHRs微动脉的胰岛素舒张水平明显下降(26.59±2.53%vs.45.59±4.22%,P<0.05)。与y WKY大鼠相比,y SHR在胰岛素刺激下血管Akt、e NOS磷酸化水平降低,ERK1/2磷酸化水平升高,ET-1的m RNA水平增加。这些结果提示幼年自发性高血压大鼠存在血管胰岛素敏感性下降,以及胰岛素Akt-e NOS—ERK1/2-ET-1信号失衡,且这一变化出现在血压升高之前。2.检测幼年自发性高血压大鼠的脂联素水平,并检测微动脉组织脂联素受体1(Adipo R1)、脂联素受体2(Adipo R2)及受体下游分子APPL1的表达水平。实验发现,与y WKY相比,y SHRs脂肪组织的脂联素m RNA水平降低(P<0.05),血浆脂联素水平降低(P<0.05);同时,肠系膜微动脉Adipo R1、Adipo R2的m RNA和水平也下降(P<0.05),APPL1的m RNA及蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。提示,y SHRs存在低脂联素血症及微动脉组织脂联素受体与APPL1表达降低。3.用脂联素球状片断(g Ad,2μg/g/day,sc)分别治疗y SHRs、y WKY各7天后,y WKY大鼠微动脉的胰岛素舒张反应与未治疗的y WKY没有明显差异,而经脂联素治疗的y SHRs微动脉的胰岛素舒张反应比未经治疗的y SHRs有显著改善(P<0.05)。同时,与未经治疗的y SHRs大鼠相比,经g Ad治疗的y SHRs微血管组织基础状态下和胰岛素孵育后的Akt、e NOS的磷酸化水平增加,而ERK1/2的磷酸化水平降低,ET-1的m RNA水平降低。此外,g Ad治疗7天后,y SHRs微血管组织Adipo R1、Adipo R2的蛋白水平未见差异,而APPL1表达水平明显增加。提示,外源性脂联素治疗可增敏y SHR的微动脉胰岛素反应性并促进其Akt-e NOS—ERK1/2-ET-1信号平衡。4.与野生型(WT)小鼠相比,脂联素基因敲除小鼠(APN-/-)血浆脂联素水平及脂肪组织脂联素m RNA水平明显降低。APN-/-小鼠肠系膜微动脉对胰岛素(10-7-10-5mol/L)的血管舒张反应较WT小鼠明显降低。同时,APN-/-小鼠微动脉Akt、e NOS的磷酸化水平降低,ERK1/2的磷酸化水平升高。与WT小鼠相比,APN-/-小鼠微动脉Adipo R1、Adipo R2蛋白水平未见变化,而APPL1 m RNA水平及蛋白水平均明显降低。g Ad治疗可部分逆转上述变化。提示,低脂联素血症及其诱导的APPL1下调可能介导了微动脉胰岛素抵抗。5.脂联素活性片段g Ad孵育HUVECs可上调APPL1蛋白表达,而用si RNA敲低脂联素受体可抑制这一作用;g Ad还可增加APPL1下游LKB1从细胞核到细胞浆的转位,AMPK磷酸化也明显增加,其下游PTEN蛋白水平降低。进一步研究发现,胰岛素预刺激后g Ad孵育组Akt、e NOS磷酸化水平和NO释放水平高于无g Ad孵育组,同时,ERK1/2磷酸化水平和ET-1释放水平降低。而用APPL1 si RNA敲低APPL1在HUVECs的表达水平,可阻断上述g Ad的效应。提示,脂联素可通过受体依赖性上调内皮细胞APPL1表达从而增强胰岛素Akt-e NOS-NO信号,抑制ERK1/2-ET-1信号,这可能是其增敏微动脉胰岛素舒血管作用的分子机制;对胰岛素信号的作用与APPL1增加其下游LKB1转位、AMPK磷酸化及降低PTEN表达有关。6.对4周龄y SHRs进行持续10周,每周5天的无负重游泳训练,发现运动后SHRs血压随着周龄的增加也逐渐升高,重要的是,运动8周及10周后SHRs血压明显低于同年龄静息的SHRs。分离同龄WKY、静息SHR组(SHR-SED)、及运动SHR组(SHR-EX)大鼠肠系膜微动脉并观察其血管功能,发现与WKY相比较,SHR-SED组大鼠微动脉的胰岛素舒张水平明显下降(P<0.05);而SHR-EX组大鼠胰岛素舒张水平较SHR-SED组大鼠部分恢复(P<0.05)。提示,开始于高血压前期的长期有氧运动可有效延缓SHRs的动脉血压升高,同时改善微动脉胰岛素抵抗。7.与WKY大鼠相比,SHR-SED组大鼠微动脉G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)蛋白水平和活性明显升高,长期有氧运动10周使SHR-EX组大鼠GRK2蛋白水平和活性显著下降。同时,与WKY大鼠相比,SHR-SED组大鼠的胰岛素刺激后Akt丝氨酸473和苏氨酸308位点磷酸化、e NOS丝氨酸1177位点磷酸化水平均降低,而长期有氧运动后(SHR-EX组大鼠)胰岛素刺激的微血管组织Akt、e NOS的磷酸化水平高于SHR-SED组相应蛋白。各组微血管组织Akt、e NOS的表达水平未见差异。提示,开始于高血压前期的长期有氧运动可显著降低微动脉组织GRK2表达和活性,同时增强胰岛素Akt-e NOS信号。8.分离培养SHR-SED组大鼠微血管动脉组织,孵育GRK2抑制剂或转染GRK2si RNA可使微血管胰岛素舒张反应较SHR-SED组大鼠微血管明显增强。同时,微血管胰岛素信号Akt丝氨酸473和苏氨酸308位点磷酸化、e NOS丝氨酸1177位点磷酸化水平增加。提示,抑制或下调GRK2可模拟长期有氧运动增敏微动脉胰岛素舒血管效应及信号转导。9.分离培养SHR-EX组大鼠微血管动脉组织,用Chariot试剂将外源性GRK2蛋白转移至细胞内,使微血管GRK2蛋白水平升高。同时,微血管胰岛素舒张反应较SHR-EX组微血管或SHR-EX+Chariot组微血管胰岛素舒张反应均明显降低,微血管胰岛素信号Akt丝氨酸473和苏氨酸308位点磷酸化、e NOS丝氨酸1177位点磷酸化磷酸化水平降低。提示,上调GRK2水平可阻断长期有氧运动增敏微动脉胰岛素的舒血管效应及信号转导的作用。结论:1.血压尚未升高的幼年SHRs存在微血管胰岛素抵抗,其机制与低脂联素血症及其诱导的APPL1表达降低有关;外源性脂联素治疗可使APPL1表达增加,从而增强胰岛素的血管活性。2.自高血压前期即开始进行的长期有氧运动可显著改善血管胰岛素敏感性,延缓高血压发生发展,其机制与下调阻力血管GRK2的蛋白水平和活性有关,提示尽早实施的长期有氧运动对预防高血压的有益作用。本研究为利用长期有氧运动锻炼、或以血管胰岛素敏感性为靶点的治疗方法,对高血压前期人群进行早期有效的干预,从而预防临床高血压及相关心血管疾病的发生发展提供了理论依据和防治策略。