论文部分内容阅读
Iturin A是芽孢杆菌属(Bacillus)细菌产生的环脂肽类抗生素,具有很强的广谱抗菌活性。但因芽孢杆菌合成Iturin的能力有限而严重制约了Iturin的产业化。本文对一株产Iturin的内生解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens CC09)发酵条件及活性物质Iturin A提取工艺进行了优化,旨在为解淀粉芽孢杆菌CC09及其活性物质Iturin A的产业化奠定基础。主要研究结果包括:1.以LB培养基为基础,采用单因子和多因子正交实验,研究了富营养培养基组成及培养条件对解淀粉芽孢杆菌CC09产Iturin A能力的影响,获得最佳摇瓶发酵条件:可溶性淀粉(碳源)5g/L、3:1胰蛋白胨酵母粉混合氮源15g/L、NaC11g/L、pH6.0、28℃、转速120r/min和装液量20%。在此条件下,Iturin A的产量高达690mg/L,较优化前的138mg/L提高5倍,每克Iturin A的培养基成本为6.96元。2.为了降低发酵成本,在调研文献的基础上,采用Plackett-Burman、中心组合设计和响应面分析等实验方法,研究了可用于工业生产的解淀粉芽孢杆菌CC09产Iturin A发酵条件。在小麦粉14g/L,黄豆饼粉25g/L,玉米粉8g/L,MgSO4 O.lg/L, MnSO42.5mg/L, FeSO40.8mg/L,装液量60mL/250mL, pH6,温度28℃、转速125r/min和发酵48h的条件下,Iturin A的产量达501mg/L,较优化前利用LB培养基在37℃、转速120r/min下培养提高4.2倍。每克Iturin A的培养基成本为0.30元,较正交实验所得发酵条件下的培养基成本降低了95.7%。3.基于响应面法得到的摇瓶发酵条件,通过调整转速、通气量和接种量,研究了解淀粉芽孢杆菌CC09产Iturin A在25L发酵罐中的发酵条件。结果表明,接种量5%、转速150r/min和通气量1.2wm条件下发酵60h,Iturin A的产量可达512mg/L,略高于响应面法得到的摇瓶发酵条件下的Iturin A产量。4.通过比较X-5、 XDA-4、 HPD300、 HPD700和D101五种大孔树脂在室温条件下对解淀粉芽孢杆菌CC09发酵液中Iturin A的吸附量及回收率的差异,发现大孔树脂HPD300对Iturin A有较强的吸附和回收作用,吸附量为87.3mg/g,较其他4种大孔树脂的吸附量高出38.7%-64.3%;回收率达91.0%,较其他4种大孔树脂的吸附量高出34.2%-75.9%。研究了大孔树脂HPD300对Iturin A的静态吸附等温线,证明其吸附特性符合Langmuir和Freundlich方程,在Iturin A浓度为370mg/L、温度为25℃下吸附效果最好;根据静态吸附结果,利用直径为2.0cm的层析柱,进行了HPD300树脂对Iturin A的动态吸附和解吸实验,确定了Iturin A纯化工艺参数为:上样流速为2BV/h,上样体积为25BV,树脂柱径高比为1:6,90%乙醇洗脱。进一步研究了大孔树脂吸附Iturin A的洗脱条件,获得了兼顾得率和Iturin A纯度的最佳梯度洗脱条件:蒸馏水(5BV)→45%乙醇(7.5BV)→90%乙醇(7.5BV)。在此条件下,Iturin A的得率高达91.2%,纯度达56.2%,较纯化前Iturin A纯度(3.6%)提高了15.6倍。通过对解淀粉芽孢杆菌CC09产Iturin A的发酵条件和Iturin A的提取工艺进行探索,最终获得低成本的发酵培养基和分离效果好的洗脱纯化工序,为解淀粉芽孢杆菌CC09及Iturin A的工业化生产提供参考。