金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)是一类应用广泛的昆虫病原真菌，在昆虫防治中起着重要作用。近十多年来，在绿僵菌的致病机制、高毒力菌株选育和应用技术等方面都取得了长足进展，并实现了商品化。绿僵菌已成功的用于防治沙漠飞蝗、东亚飞蝗等多种蝗虫，已成为防治蝗虫的主要微生物农药，杀蝗绿僵菌1989年被联合国粮农组织(FAO)推荐为环保产品推广应用。作为一种触杀性微生物杀虫剂，金龟子绿僵菌以孢子为杀虫单元侵染昆虫，但是由于高温、紫外线辐射、干燥等逆境对孢子的不利作用，杀虫真菌制剂在田间应用中的防效受到明显影响。而且在传统的真菌杀虫剂研制中，菌株的选育注重于高毒力菌株的选育，忽略了产孢过程对商品制剂生产的影响和孢子特性对菌株毒力以及制剂货架时间、田间时效性的影响。所以除了常规育种来选育高毒力菌株和分子生物学方法鉴定分离毒力相关基因之外，也应该重视孢子特性和产孢相关基因的克隆和鉴定，从而阐明产孢及孢子特性等重要相关性状形成的分子机制。这直接关系到缩短产孢时间，提高产孢率，增强孢子耐储藏性、抗逆境性等重要的剂型研制目标，为选育产孢快、产孢率高、孢子特性优良的工程菌株提供相应的理论依据和目的基因，从而更好地实现绿僵菌作为生物杀虫剂的规模化应用。　　 目前，对于金龟子绿僵菌产孢的研究，主要是从环境因素和理化因子的角度来探索，而对于其孢子形成的分子机制的系统研究还少见报道。为了填补这个领域的空缺，本实验室已经利用消减杂交技术分别得到大量绿僵菌微循环产孢和正常产孢时产孢细胞形成过程中差异表达的基因。　　 本文选取其中一个上调表达的基因，在PCR扩增金龟子绿僵菌产孢时期均一化cDNA全长文库和筛选金龟子绿僵菌基因组文库的基础上，获得了该基因的cDNA全长序列和DNA序列，并命名为MaECM33。同时，构建MaECM33基因的RNA干扰载体并转化金龟子绿僵菌，以期利用RNA干扰的方法来研究该基因的功能。根据试验结果主要得出以下结论：　　 1.克隆了金龟子绿僵菌ECM33基因的cDNA，序列全长1396bp含有一个1167bp的完整开放阅读框(ORF)，编码388个氨基酸的蛋白质。提交GenBank,登录号为：FJ788387。命名为：MaECM33。　　 2.根据MaECM33的cDNA序列推导出一个388个氨基酸的蛋白质，推导蛋白理论分子量为40443.0 Da，等电点为5.52。经http://www.cbs.dtu.dk/预测，发现包括起始蛋氨酸在内连续19个氨基酸残基为信号肽。通过Blast比对分析，表明该基因编码产物为一种糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(glycosylphos phatidylinositol anchored protein，GPI-AP)。　　 3.通过菌落原位杂交筛选金龟子绿僵菌基因组文库，获得MaECM33基因的DNA序列，将结构基因序列与cDNA序列用bl2seq软件进行比对，结果表明结构基因含两个内含子，长度分别为58bp和66bp，其中一个内含子(969-1035)有典型的GT…AG边界，而另一内含子(73-130)其边界为TG…GG。　　 4.Southern杂交表明，MaECM33以单拷贝的形式存在于绿僵菌基因组中。　　 5.构建了MaECM33基因的RNA干扰载体(pbar-RNAi-gpd-trp-ECM33)，该干扰载体以质粒pBTM为基本骨架，在该质粒引入一个抗除草剂(ammonium glufosinate)的筛选标记bar基因，在bar终止子的3端顺次插入来自于构巢曲霉的gpdA启动子和trpC启动子序列。在两个启动子之间是一个多克隆位点(MCS)，用于插入外源目的基因。　　 6.用基因枪法成功地将MaECM33基因的RNA干扰载体(pbar-RNAi-gpd-trp-ECM33)转化到金龟子绿僵菌中。相比其他转化方法，基因枪法具有转化受体操作迅速、简单，转化效率高，转化子稳定的优点。　　 7.由于干扰载体具有抗除草剂的筛选标记bar基因，将转化后的绿僵菌孢子接种于含有除草剂的查氏培养基上，筛选得到一批转化子，经传代培养和PCR验证，最终获得两个稳定的转化子Ma1和Ma2。　　 8.对转化子进行初步的表型分析，结果表明在生长的菌落形态和产孢数量方面转化子与野生型菌株无显著差异。初步推断，可能是MaECM33基因的沉默被其它功能相同的基因所代偿或者低水平的基因沉默并不足已引起表型上的变化。