阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种发病率较高、危害性较大的神经系统退行性疾病，其主要临床特征为进行性认知和记忆功能减退。β-淀粉样蛋白（β-Amyloid protein，Aβ）在脑内的生成和沉积所形成的老年斑（senile plaque，SP）在AD的病理过程中起重要的作用。Aβ生成增加、酶介导的Aβ降解不足以及Aβ从脑内清除减少是导致Aβ聚集的重要原因。过量的Aβ聚集后形成淀粉样沉积和老年斑，从而产生神经毒性，出现认知及记忆功能损害。三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）与Aβ代谢联系紧密。ABCA1蛋白缺失会导致脑内载脂蛋白E（apolipoprotein E，apoE）荷脂减少和Aβ水平增加。ABCA1蛋白过表达会增加脑内apoE荷脂和减少Aβ水平，进而对AD产生影响。ABCA1高表达时，Aβ生成减少，降解和清除增加。鉴于ABCA1在Aβ的代谢和集聚中起非常重要作用，可以将ABCA1作为治疗AD的一个重要靶点。因此，寻找一种能有效增加ABCA1表达的物质变得至关重要。Apelin是脂肪细胞分泌的一种具有生物活性的肽类激素，在体内具有广泛的组织学分布。近来研究表明，Apelin在海马神经元保护过程中起重要的作用。基于海马神经元在学习与记忆中具有重要的地位，提示apelin对学习记忆具有调节作用。我们前期研究表明，Apelin-13增加THP-1源性巨噬细胞ABCA1水平，但其对Aβ代谢的作用目前尚不清楚。鉴于ABCA1蛋白与Aβ代谢之间的密切关系，我们提出以下假设：apelin-13通过增加ABCA1蛋白水平减少Aβ沉积及改善AD模型鼠认知与记忆功能。本课题分三个部分来验证假设，第一部分使用apelin-13处理大鼠嗜铬细胞瘤细胞株（PC-12细胞，具有神经内分泌细胞特性），观察apelin-13是否通过影响ABCA1蛋白水平从而调节PC-12细胞Aβ代谢，并阐明其机制。第二部分使用apelin-13处理APP/PS1转基因小鼠，观察apelin-13是否改善AD模型鼠的认知记忆功能及减少其Aβ沉积。第三部分使用ABCA1SiRNA沉默APP/PS1转基因小鼠脑组织ABCA1表达，观察apelin-13是否通过ABCA1蛋白改善AD模型鼠的认知记忆功能及减少其Aβ沉积。本研究对AD的防治提供了一个新的实验依据。第一部分Apelin-13增加PC-12细胞ABCA1蛋白水平调节Aβ代谢目的：观察apelin-13是否通过影响ABCA1蛋白水平从而调节Aβ代谢，并阐明其机制。方法：①Western blot检测PC-12细胞血管紧张素受体AT1相关的受体蛋白（putative recep tor p rotein related to the angiotensin recep tor AT1，APJ）表达，以确定PC-12细胞存在apelin-13作用受体。②用不同浓度（1、10、100nmol/L）的apelin-13处理PC-12细胞24h及用100nmol/L apelin-13处理细胞24不同时间（12h、24h、48h）后，酶联免疫吸附法（ELISA）检测Aβ1-40及Aβ1-42水平，Western blot免疫印迹法检测APP、BACE1及NEP蛋白水平，根据试剂盒方法检测BACE1及NEP酶活性，RT-PCR检测ABCA1mRNA水平，Western Blot检测ABCA1蛋白水平，液体闪烁计数法检测细胞内胆固醇的流出。③先使用ABCA1SiRNA抑制PC-12细胞ABCA1蛋白表达，再使用100nmol/L apelin-13处理PC-12细胞24h，ELISA检测Aβ1-40及Aβ1-42水平，根据试剂盒方法检测BACE1及NEP酶活性。以确定ABCA1在apelin-13对PC-12细胞Aβ代谢影响中所起的作用。④先使用PKCαSiRNA抑制PKCα表达，再使用100nmol/L apelin处理PC-12细胞24h，检测apelin对ABCA1蛋白水平的影响。使用不同浓度（1、10、100nmol/L）的apelin-13处理PC-12细胞24h，检测钙调蛋白（calpain）活性。⑤使用不同浓度（1、10、100nmol/L）apelin-13处理PC-12细胞24h，Western blot方法检测apoE蛋白表达水平。使用apoE SiRNA抑制apoE表达，100nmol/L apelin处理PC-12细胞24h，检测apelin对BACE1及NEP酶活性的影响。结果：①PC-12细胞存在APJ表达。②Apelin-13显著降低PC-12细胞Aβ1-40及Aβ1-42水平，对APP、BACE1及NEP蛋白表达无显著影响，降低BACE1酶活性，增加NEP酶活性，对ABCA1mRNA水平无影响，增加ABCA1蛋白水平，促进胆固醇流出，减少细胞内脂质蓄积。③使用ABCA1SiRNA抑制PC-12细胞ABCA1蛋白表达后，apelin-13降低PC-12细胞Aβ1-40及Aβ1-42水平的作用显著减弱，其降低BACE1酶活性及增加NEP酶活性的作用显著抑制。④使用PKCαSiRNA抑制PC-12细胞PKCα表达后，apelin增加ABCA1蛋白水平的作用减弱；Apelin-13显著抑制PC-12细胞calpain活性。⑤Apelin-13对PC-12细胞apoE蛋白表达无显著影响；使用apoE SiRNA抑制PC-12细胞apoE表达后，apelin-13降低BACE1酶活性及增加NEP酶活性的作用显著减弱。结论：①Apelin-13通过PKCα途径增加PC-12细胞ABCA1蛋白水平；②Apelin-13通过增加PC-12细胞ABCA1蛋白水平，降低BACE1活性减少Aβ生成、增强NEP活性增加Aβ降解，从而减少Aβ水平。第二部分Apelin-13改善APP/PS1小鼠认知与记忆功能目的：观察apelin-13是否影响APP/PS1小鼠认知与记忆功能及脑组织Aβ代谢。方法：用不同剂量（1、2、4μg）的apelin-13侧脑室注射处理APP/PS1小鼠30天（1次/天）后，Y迷宫实验、新物体识别实验及Morris水迷宫实验检测小鼠认知与记忆功能。随后处死小鼠，ELISA检测小鼠海马和前额叶组织的Aβ1-40及Aβ1-42水平，刚果红染色检测海马组织Aβ沉积情况，Western blot检测海马和前额叶组织APP、BACE1及NEP蛋白水平，根据试剂盒方法检测海马和前额叶组织BACE1及NEP酶活性，ELISA检测小鼠外周血Aβ1-40及Aβ1-42水平，Western blot检测海马和前额叶组织ABCA1蛋白水平。结果：Apelin-13显著提高APP/PS1小鼠在Y迷宫实验中的正确率，显著增加APP/PS1小鼠在新物体识别实验中（无论是短时检测还是长时检测）对新物体的认知能力，并且显著减少APP/PS1小鼠在Morris水迷宫实验中的平均游泳距离及平均潜伏期。Apelin-13显著降低APP/PS1小鼠海马和前额叶组织的Aβ1-40及Aβ1-42水平，对APP、BACE1及NEP蛋白水平无显著影响，减少海马和前额叶组织BACE1酶活性，增加NEP酶活性，显著增加外周血Aβ1-40及Aβ1-42水平，显著提高海马和前额叶组织ABCA1蛋白水平。结论：①Apelin-13改善APP/PS1小鼠的认知与记忆功能；②Apelin-13减少APP/PS1小鼠海马和前额叶组织Aβ生成，增加Aβ降解及清除。③Apelin-13增加APP/PS1小鼠海马和前额叶组织ABCA1蛋白水平。第三部分Apelin-13通过ABCA1改善APP/PS1小鼠的认知与记忆能力目的：观察apelin-13是否通过ABCA1蛋白影响APP/PS1小鼠认知与记忆功能及脑组织Aβ代谢。方法：使用ABCA1SiRNA侧脑室注射沉默APP/PS1小鼠脑组织ABCA1蛋白表达，观察apelin-13对AD模型小鼠认知与记忆功能及脑组织Aβ代谢的影响。Y迷宫实验、新物体识别实验及Morris水迷宫实验检测小鼠认知与记忆功能。处死小鼠，ELISA检测小鼠海马和前额叶组织的Aβ1-40及Aβ1-42水平，刚果红染色检测海马组织Aβ沉积情况，试剂盒检测海马和前额叶组织BACE1及NEP酶活性，ELISA检测小鼠外周血Aβ1-40及Aβ1-42水平。结果：当脑组织ABCA1表达被沉默后，Apelin-13对APP/PS1小鼠认知记忆功能及脑组织Aβ沉积的改善作用减弱，Apelin-13对APP/PS1小鼠海马和前额叶组织BACE1活性的抑制作用及对NEP活性的促进作用降低，Apelin-13增加外周血Aβ1-40及Aβ1-42水平的效应下降。结论：①Apelin-13通过增加ABCA1蛋白水平改善APP/PS1小鼠的认知与记忆功能；②Apelin-13通过增加ABCA1蛋白水平减少APP/PS1小鼠海马和前额叶组织Aβ生成，增加Aβ降解及清除。