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背景:肺癌不仅是全球发病率最高的恶性肿瘤疾病,其死亡率同样居所有肿瘤之首。非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌中最常见的病理类型,而腺癌则是NSCLC中最常见的病理类型。随着肿瘤免疫微环境（Tumor Immune Microenv ironment,TIME）概念的提出,越来越多的研究证明TIME与肺癌患者的疗效及预后密切相关,而如何改善TIME以增强肿瘤免疫成为了新的研究热点,近年来中医药在调节和重塑TIME方面体现出一定优势。芪甲扶正方是李忠教授根据“扶正固摄”法而拟定的中药复方,该方已应用于临床治疗肺癌多年,前期研究结果显示芪甲扶正方具有一定抑瘤作用,并能改善NSCLC患者的临床症状,但对患者总体生存的影响及T IME的调节机制尚不清楚,因此希望通过本研究对这些问题进行初步探索。目的:1.采用生物信息学分析和网络药理学方法,分析肺腺癌TIME的特点,预测芪甲扶正方调节肺腺癌TIME的潜在靶点和机制;2.构建Lewis肺癌荷瘤小鼠模型,观察芪甲扶正方对荷瘤小鼠皮下移植瘤的抑制作用,以及对小鼠外周免疫功能的调节作用;3.采用动物实验研究,验证通过生物信息学和网络药理学研究预测获得的关键靶点,分析芪甲扶正方对肺腺癌TIME的调节机制;4.基于真实世界研究方法,开展回顾性队列研究,评价以芪甲扶正方为主的中药复方对NSCLC患者生存的影响。方法:1.通过TCGA数据库下载LUAD项目的mRNA数据和临床数据,从ESTIMATE数据库获得LUAD项目中各样本的Immune score和Stromal score,根据两种评分的中位值分组,并采用Log-rank检验分析不同免疫评分组间的生存差异。运用Cibersort算法分析不同评分组间免疫细胞分布差异,利用limma包筛选组间差异表达基因（Different ial expressed genes,DEGs）。2.从TCMIO和TRRUST数据库中获取芪甲扶正方药物靶点,将药物靶点与肺腺癌TIME相关DEGs交集映射后得到共有靶点,通过STRING数据库构建共有靶点的PPI网络,并利用CytoHubba插件筛选网络中的关键靶点,利用TIMER数据库对关键靶点与肿瘤纯度、免疫细胞浸润程度进行相关性分析。3.构建Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤模型,随机分为模型对照组、中药组、顺铂组和中西医组,并设置正常对照组,每组6只小鼠。荷瘤小鼠分别给予生理盐水、芪甲扶正方药液、顺铂、中药联合顺铂干预。药物干预期间测量皮下移植瘤体积,药物干预结束后取小鼠胸腺及脾脏,根据小鼠体重和脏器质量计算脏器指数,采用流式细胞术检测外周血CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的比例。4.HE染色观察肿瘤组织形态,免疫组化染色观察CD8+T细胞的浸润程度,并采用Western Blot检测肿瘤组织中STAT1和CXCL10的表达水平。5.回顾性临床研究以NSCLC为研究对象,中西医结合治疗病例来源于北京中医药大学东直门医院,西医治疗病例来源于美国国立癌症研究所数据库（The Surveillance E pidemiology and End Results,SEER）。采用倾向性评分匹配法（Propensity score matc hing,PSM）将中西医结合队列和西医队列按照1:1比例进行匹配,卡钳值设置为0.001,采用Log-rank检验比较匹配后两队列的总生存期（Overall survival,OS）。结果:1.芪甲扶正方调节肺腺癌TIME的机制预测（1）肺腺癌TIME特征分析:分别根据Immune score和Stromal score的中位值将TCGA-LUAD肿瘤样本分为高低分组,生存分析显示高Immune score组患者OS明显优于低分组（P<0.05）,而Stromal score组间OS无明显差异。免疫细胞含量分析结果显示高Immune score组样本中记忆B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞等含量明显高于低分组（P<0.05）。高低Immune score组间筛选出752个DEGs,生物学富集分析发现DEGs主要涉及:①MF:抗原结合、细胞因子活性、细胞因子受体活性、蛋白结合、趋化因子活性等分子功能;②BP:激活细胞表面受体信号通路的免疫应答、淋巴细胞活化的调节、T细胞活化等生物学等过程;③CC:T细胞受体复合体、质膜受体复合体、质膜外侧等细胞组分。KEGG通路富集分析结果显示DEGs主要与造血细胞谱系、细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞粘附分子、趋化因子信号等通路相关。此外,通过S TRING 构建 DEGs 的 PPI 网络,并筛选得到 CCR7、CTLA4、CD86、CD80、FOXP3 等20个重要分子。（2）芪甲扶正方调节肺腺癌TIME机制预测:通过TCMIO和TRRUST数据库获得芪甲扶正方的64个肿瘤免疫靶点及515个下游调控的靶基因,这些靶点和肺腺癌TI ME相关DEGs映射后获得39个共有靶点。网络拓扑分析方法筛选出共有靶点PPI网络中5个关键靶点:CCL3、IL10、CXCL10、FOXP3、CD86。根据各靶点的相关系数、M CC值和差异倍数,CXCL10可能是芪甲扶正方调节肺腺癌TIME的核心靶点。转录因子STAT1能调控CXCL10的表达,而CXCL10可招募CD8+T细胞,相关性分析结果显示 STAT1、CXCL10 和 CD8 三者互为正相关性（r=0.764,r=0.671,r=0.570,P<0.001）,同时,GSEA富集分析显示CXCL10高表达时JAK-STAT通路处于上调状态。2.芪甲扶正方对Lewis肺癌荷瘤小鼠瘤体生长和免疫功能的影响（1）芪甲扶正方对Lewis荷瘤小鼠瘤体的影响:中西药组小鼠的肿瘤体积最小,明显小于中药组和模型对照组（P<0.05）,顺铂组和中药组小鼠的肿瘤体积小于模型对照组（P<0.05）。（2）芪甲扶正方对Lewis荷瘤小鼠免疫功能的影响:中药组和正常对照组小鼠的胸腺指数明显高于顺铂组（P<0.05）。脾脏指数方面,中药组和中西药组小鼠的脾脏指数明显高于顺铂组和正常对照组（P<0.05）,顺铂组小鼠的脾脏指数明显低于模型对照组（P<0.05）。流式细胞术检测发现各组间外周血CD3+、CD8+淋巴细胞水平无明显差异,中药组的CD4+T淋巴细胞和CD4/CD8水平明显高于模型对照组、顺铂组和中西药组（P<0.05）。采用Procarta Plex TM多因子技术检测小鼠外周血IFN-γ和CXCL10水平,结果显示中西药组小鼠的IFN-γ、CXCL10水平明显高于模型对照组（P<0.05）。3.芪甲扶正方通过STAT1/CXCL10轴促进肺腺癌TIME中CD8+T细胞浸润免疫组化染色结果显示,中西药组、顺铂组和中药组肿瘤组织的CD8表达明显高于模型对照组（P<0.05）,中西药组CD8阳性细胞占比还明显高于中药组和顺铂组（P<0.05）。Western blot检测结果显示,中西药组的STAT1蛋白表达水平明显高于模型对照组、顺铂组和中药组（P<0.05）,中药组和顺铂组STAT1表达水平也明显高于模型对照组（P<0.05）。中西药组CXCL10蛋白表达水平明显高于模型对照组和中药组（P<0.05）,中药组和顺铂组CXCL10蛋白表达水平明显高于模型对照组（P<0.05）。4.芪甲扶正方对NSCLC患者生存的影响（1）中西医结合队列:中西医结合队列共纳入NSCLC患者511例,生存分析结果显示1年、3年、5年生存率分别为73.1%、56.9%和50.3%。临床特征分层组间生存分析结果显示,低龄（<65岁）、女性、腺癌、N0、M0患者的OS更长。（2）西医治疗队列:SEER数据库纳入NSCLC病例5022例,1年、3年、5年生存率分别为43.5%、18.3%和10.7%。临床特征分层组间生存分析显示,低龄、女性、腺癌和鳞癌、N0、M0、AJCC分期较早的患者OS更佳。（3）两队列生存比较:两队列经PSM匹配后各获得61例样本,各临床特征组间均无明显差异,生存分析结果显示中西医结合队列患者的OS优于西医治疗队列患者（P<0.05）。结论:1.高免疫细胞浸润的肺腺癌患者OS优于低浸润者,芪甲扶正方可能通过多靶点、多通路对肺腺癌TIME产生调节作用。2.芪甲扶正方能够有效抑制Lewis肺癌小鼠肿瘤生长,并且可通过提高小鼠免疫器官指数、外周血CD4+T淋巴细胞亚群的比例、CD4+/CD8+T细胞比值、IFN-γ水平达到增强小鼠外周免疫功能的作用。3.芪甲扶正方可能通过调节STAT1/CXCL10信号轴促进肺腺癌TIME中CD8+T淋巴细胞的浸润,从而发挥抗肿瘤作用。4.在常规西医治疗的基础上,联合以芪甲扶正方为主的中药复方治疗可能在一定程度上有益于NSCLC患者的生存。