论文部分内容阅读
目的：构建并转染针对肝癌细胞系沉默Cdc42的高效率RNA干扰载体。在体内外实验探讨Cdc42-shRNA重组质粒对肝癌细胞SMMC-7721增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为的影响。方法：根据Genebank报道的Cdc42的mRNA序列，利用Promega公司siRNA在线设计软件设计特征的靶序列，分别合成3对寡核苷酸链，克隆到含U6启动子的pBS/U6载体，进行酶切鉴定和测序。采用脂质体法将构建的载体转染至肝癌细胞SMMC-7721中，用Westernblot及免疫荧光染色检测对Cdc42蛋白表达的抑制情况。采用计数法绘制细胞生长曲线；MTT法检测细胞增殖；划痕愈合实验方法测定细胞迁移能力；穿孔迁移实验方法观察细胞的侵袭能力。Westernblot方法检测PCNA和AFP蛋白表达。建立裸鼠皮下人肝癌移植瘤模型，观察裸鼠成瘤情况，免疫组织化学方法检测裸鼠瘤块中Cdc42的表达情况。结果：酶切鉴定和测序结果证实Cdc42-shRNA重组质粒构建完全正确；转染肝癌细胞SMMC-7721后，Westernblot检测肝癌细胞内源性Cdc42表达明显抑制。免疫荧光方法结果显示肝癌细胞荧光强度显著下降。细胞计数法显示转染Cdc42-shRNA2细胞生长速度明显减慢。MTT实验显示转染重组质粒后吸光度显著降低，并且呈剂量依赖性。划痕实验显示转染Cdc42-shRNA2的SMMC-7721细胞划痕愈合能力显著减弱，相对迁移距离比较差异显著。穿孔迁移实验方法显示肝癌细胞侵袭能力明显减弱。显著地抑制肝癌细胞的肿瘤标志蛋白AFP的表达水平及细胞增殖抗原PCNA表达水平。裸鼠成瘤实验转染组肿瘤生长速度减慢，瘤块重量明显减小。瘤块免疫组化结果Cdc42表达明显减弱。结论：成功构建了Cdc42-shRNA表达载体；并成功转染肝癌SMMC-7721细胞，高效地抑制了肝癌细胞内源性Cdc42的表达。Cdc42干扰质粒成功地转染肝癌SMMC-7721细胞后，明显改变了人肝癌细胞的恶性生物学行为，细胞生长速度减慢，增殖能力降低，细胞的迁移和穿过Matrigel胶的侵袭能力均有不同程度的降低；发现RNAi沉默Cdc42表达导致了AFP蛋白和PCNA蛋白表达含量的明显改变，降低肝癌细胞的恶性程度；体内成瘤实验也证实RNA干扰技术可沉默肝细胞癌Cdc42蛋白的表达，并且明显抑制肿瘤生长。