Bt cry3Aa基因表达载体的构建及农杆菌介导的甘薯茎段遗传转化

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甘薯(Ipomoea batatas Lam.)是世界上重要的农作物和工业作物,又兼具抗癌、保健的功效,因此在全世界广泛种植。甘薯害虫种类多样,危害方式不尽相同,每年因害虫造成甘薯减产给国家带来的损失无法估计。而常规的甘薯品种缺乏对田间害虫的天然抗性,依靠常规育种手段也难以解决上述问题。目前控制甘薯害虫的手段多以化学杀虫剂为主,既提高了生产成本又对环境产生污染,并且化学物质的残留会对食用者造成安全隐患。因此,亟需发现并利用一种新型的手段来培育甘薯抗虫新品种。Bt基因被认为是一种针对害虫有特异性杀虫活性,而对人、畜等非目标生物无害的抗虫基因,因其优良的特性,目前在世界范围内广泛应用。Bt cry3Aa基因对鞘翅目昆虫有专一杀灭活性,将该基因导入到甘薯中,培育并获得转基因甘薯可以对鞘翅目害虫甘薯小象甲产生一定抵抗作用,以达到抗虫并增加甘薯产量的目标。  本研究的主要结果是:  1.Bt cry3Aa基因序列的上游5端引入了KpnⅠ、BamHⅠ限制性内切酶酶切位点和PTD接头,在下游3端引入了SalⅠ酶切位点,且利用甘薯密码子偏好性对cry3Aa进行改造后于公司合成。  2.合成后的基因经酶切、连接、转化等步骤最终获得双元表达载体pCAMBIA1301-cry3Aa与pCAMBIA1301-PTD-cry3Aa。  3.通过农杆菌介导的不经植物组织培养阶段的甘薯遗传转化体系的探索,初步建立了一种适合广薯87号甘薯品种的转化策略,在菌液OD600=0.4,侵染时间10min,AS浓度在25-50mg/L之间,Carb浓度为200mg/L时,获得甘薯阳性株的机率最大。  4.转化后植株长出的新叶片利用PCR鉴定。结果表明在检测的7株转cry3Aa的植株上,共有2株阳性株;在检测的11株转PTD-cry3Aa的植株上,共有3株阳性株。
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