【摘 要】
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核心结合因子(core-binding factor α1,Cbfa1)是近几年发现的与骨发育密切相关的转录因子,在成骨细胞分化和骨形成过程中发挥重要作用.该研究利用腺病毒载体系统,构建hCbfa1
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核心结合因子(core-binding factor α1,Cbfa1)是近几年发现的与骨发育密切相关的转录因子,在成骨细胞分化和骨形成过程中发挥重要作用.该研究利用腺病毒载体系统,构建hCbfa1腺病毒载体,以用于人造骨移植修复骨缺损.用PCR法从质粒中扩增hCbfa1基因,凝胶回收后补平末端,与粘粒载体pAwCAwt连接,用λ噬菌体蛋白包装后转化大肠杆菌.挑取菌落进行菌落PCR筛选出含有目的片段的克隆,用BamH Ⅰ酶切进一步筛选出正向插入的克隆,最后进行测序,测序结果与GenBank的hCbfa1基因序列对比,有一个同义突变.所得粘粒pAxCAwt.hCbfa1与DNA-TPC用磷酸钙沉淀法共转染293细胞,在其中同源重组,得到有感染活性的第一代病毒Ad.hCbfa1.在第二代病毒筛选中,选择只能使293细胞产生病态反应而不能使Hela细胞产生病态反应的病毒,因为它们没有E1基因不能在非293细胞中繁殖.然后进行第三代和第四代病毒扩增,并且进行筛选,排除野生型的病毒.用50﹪组织培养感染量TCID<,50>法测定病毒滴度为4.7×10<8>pfu/ml.用Ad.hCbfa1感染Hela细胞后提取细胞RNA,经紫外分光光度计定量分析,OD<,260>/OD<,280>=1.97,OD<,260>/OD<,230>值为2.05,RNA浓度=1.572μg/μl.用DNase去除RNA中的基因组DNA,然后用RT-PCR法鉴定,能够扩增出1500bp左右的片段,说明所提取的mRNA反转录得到的cDNA中含有目的基因.
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