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通过构建三个双元载体的质粒pDsE、pDsG和pAc和农杆菌介导的T-DNA转基因,发展了一个带有基因捕获器和增强子捕获器的Ac/Ds转座子系统作为插入序列标签来研究水稻基因组。主要研究结果如下: 1.通过农杆菌介导的T-DNA转基因,共获得1188株独立可育的转基因水稻植株。其中来自日本晴的转基因水稻为526株包括NAc(转pAc)51株,NE(转pDsE)361株,NG(转pDsG)114株;来自中花-11号的转基因水稻为662株,包括CAc(转pAc)176株,CE(转pDsE)320株,CG(转pDsG)166株。潮霉素抗性试验表明T-DNA在水稻染色体中平均插入位点数为1.3个;通过Southern杂交分析,T-DNA在水稻基因组中的平均拷贝数为1.8个。 2.T-DNA插入到水稻基因区的GC%含量分布与插入到基因组DNA的分布基本一致。通过对126个T-DNA插入位点两侧500bp水稻序列GC含量分析,表明插入位点处水稻基因组DNA平均GC含量为42.5%。83%的T-DNA插入子落在水稻GC含量为30-50%的基因组区域。有50个T-DNA(40%)插入到水稻的基因区。 3.T-DNA在水稻基因组DNA的插入,既有准确的插入,又有不准确的插入。在182个T-DNA与水稻的结合序列析中,只有69个序列(38%)中没有filler-DNA的存在;而存在filler-DNA的序列有113个,占总数的62%,长度从1bp到数百bp不等。通过对61个大于50bp的filler-DNA分析,发现来自T-DNA内部的DNA序列是filler-DNA的主要来源,总共有49个占总数的80%;有8个(13%)是来自于T-DNA以外的双元载体主干序列;另有4个(7%)与水稻序列和载体序列都没有同源性。在158个右边界旁邻序列中有77个保持了特征序列TGA;而左边界序列的变化比较大,没有发现在某一特定核苷酸断裂的现象。在T-DNA左边界与水稻基因组DNA直接相联的序列中发现有1-8个碱基的同源序列存在。另外还发现有16例T—DNA RB—LB的直接串联。 4.Ds元件附近的基因组DNA结构对跳跃频率有影响,PCR分析表明,来自11个Ds亲本总共20个F2群体其Ds跳跃频率变化范围为0-40%;而亲本Ds元件拷贝数对Ds的跳跃频率影响不大。Southern杂交结果表明,Ds在F2群体中的重新插入频率和独立插入频率都保持在70%以上。有Ds插入但没有Ac元件而稳定插入的F2植株频率变化范围在14-33%之间。 5.Ds在水稻基因组DNA中有插入到基因区的倾向。在29个Ds插入位点旁邻博士学位论文:Ac/D夕转座子标签在水稻中的应用 序列的分析中,有17个(59%)插入到了基因区,其中有6个在启动子区域, 7个在外显子区域,有4个在内含子区域。另外还有10个序列位于非基因区 域。Ds插入位点的两侧会形成sbP水稻碱基的正向重复。6.在Ds独立插入的FZ水稻植株的叶、根、花和种子中,增强子捕获器的GUS 活性的检出率为28%,基因捕获器的GUS活性检出率为22%。