痒（itch,或称pruritus）是一种可以引发厌恶情绪的主观感受,通常会诱发搔抓行为。急性痒刺激,例如蚊虫叮咬诱发的痒,可以使人们避免外界伤害性刺激,然而慢性痒则迁延难愈,严重影响患者的生活质量。目前,尽管痒在外周及脊髓水平的传递和调控机制已有较多研究,但针对痒信息自脊髓向更高级中枢传递的神经通路是与传统的浅感觉（尤其是痛觉）通路相同,还是另有它途,则尚缺乏足够认识。既往人们对痒和痛信息传递与调控的机制缺乏深入了解,曾一度认为痒和痛属于相同的感觉和行为反应,痒觉仅是痛觉的微弱反应。但近年的研究证明脊髓背角（spinal dorsal horn,SDH）存在胃泌素释放肽受体（gastrin releasing peptide receptor,GRPR）阳性中间神经元,可特异性将痒信息先传递至SDH的投射神经元,再经其传递至臂旁核（parabrachial nucleus,PBN）,最后传向高级中枢——大脑皮层;此通路不参与痛信息传递,提示机体存在痒信息的“专门通路”（labeledline）。同时,PBN作为重要的中继核团,主要接受SDH内P物质受体（substanceP receptor,SPR）阳性神经元的传入,并发出投射纤维至丘脑、杏仁核、下丘脑和中脑导水管周围灰质（periaqueductal gray,PAG）,与这些结构之间形成纤维联系。本科室前期工作在多种急、慢性痒模型中观察到小鼠丘脑背侧中线/板内复合体（dorsal midline and intralaminar complex,dMITC）内即刻早期基因表达的FOS蛋白增加,提示该核群可能参与痒信息的传递或调控过程。另外,我们还用形态学方法证明PBN至dMITC存在密集的投射,这些投射纤维的终末主要分布于丘脑室旁核（paraventricular thalamic nucleus,PVT）和丘脑中央内侧核（central medial thalamic nucleus,CM）。PVT 及 CM在痛信息传递中均扮演重要角色,但其是否参与痒信息的传递及其具体的神经通路和调控机制尚不知晓。据此,我们提出以下问题:机体是否存在脊髓至dMITC的直接投射并参与痒信息的传递?PBN至dMITC内PVT及CM是否存在纤维联系以及这些联系是否参与痒信息的传递或调控过程?若存在PBN至PVT及CM的纤维联系,这些通路内哪些类型的神经元参与痒信息的传递和调控?PVT及CM进一步将痒信息向边缘系统的哪些区域进行传递?为了回答上述问题,本研究综合利用形态学、光遗传学、行为药理学、纤维成像、化学遗传学和膜片钳记录等方法,观察脊髓向dMITC是否存在直接或间接的神经传导通路,为痒信息的传递通路提供基础。在此基础上,进一步干预PBN至PVT及CM的神经通路,研究激活或抑制这些通路时对小鼠急、慢性痒和痛阈值以及负性情绪的影响。该论文主要分为以下五个部分分别进行叙述:1.脊髓背角至臂旁核或丘脑背侧中线/板内复合体神经传导通路的形态学研究（1）小鼠SDH向dMITC或PBN发出直接投射:将逆标示踪剂荧光金（Fluoro-gold,FG）分别注射入小鼠的PBN及dMITC并建立急性痒模型,小鼠脊髓背角浅层可见SPR阳性神经元向dMITC或PBN发出纤维投射,且部分SPR阳性神经元在急性痒条件下表达FOS蛋白。（2）小鼠SDH向PBN和dMITC发出分支投射:将两种逆标示踪剂四甲基罗达明（tetramethylrhodamine-dextran,TMR）及 FG 分别注射至小鼠左侧 dMITC 及PBN并建立急性痒模型。小鼠SDH浅层可见TMR/FG双标分支投射神经元分布,且其中部分呈SPR阳性或表达痒刺激引起的FOS蛋白。（3）小鼠SDH至dMITC的间接神经传导通路:利用顺标示踪病毒及FG逆行标记方法标记此间接通路。在PBN内可见痒刺激激活并向dMITC投射的神经元与SDH浅层投射神经元发出的上行投射神经纤维和终末之间存在密切接触。此外,利用病毒策略可观察到SDH-PBN-dMITC通路投射纤维及终末,提示SDH与dMITC之间尚存在经过PBN中继的间接神经传导通路。上述结果提示SDH可通过向PBN及dMITC的直接投射、向PBN和dMITC的分支投射和SDH-PBN-dMITC间接投射通路将痒信息向dMITC传递。2.丘脑室旁核参与痒信息调控的形态学和机能学研究（1）急性痒刺激激活PVT:急性痒刺激条件下小鼠PVT内的FOS蛋白免疫组化染色阳性（FOS-ir）神经元数目显著升高。利用化学遗传学技术对PVT进行原位调控时,激活小鼠PVT后小鼠搔抓次数减少且诱发痛敏;抑制PVT后小鼠搔抓次数无明显增加,提示PVT参与痒信息的调控。（2）PVT接受来自PBN的痒信息传递:将FG注入小鼠PVT,PBN内大部分FG逆标神经元为囊泡膜谷氨酸转运体-2（vesicular glutamate transporter 2,VGluT2）阳性。急性痒刺激条件下,部分VGluT2/FG双标神经元同时为FOS-ir神经元,即急性痒刺激激活PBN向PVT投射的谷氨酸能神经通路。（3）PBN向PVT投射的神经通路参与痒感受的行为学研究:利用化学遗传学特异性激活PBN向PVT投射的神经通路显著抑制小鼠搔抓行为且降低小鼠痛阈;抑制该通路使小鼠自发痒搔抓次数升高而痛阈不变。利用光遗传技术激活PBN向PVT投射的神经通路可降低小鼠痒搔抓次数,同时诱发小鼠痛敏及焦虑样行为。（4）PVT内AMPA受体阳性神经元参与痒信息的传递与调控:利用光遗传结合行为药理学方法观察PVT内接受PBN投射并参与痒信息传递和调控的神经元亚型。蓝光激活PBN向PVT的上行神经通路时,动物的搔抓行为明显减少且痛阈降低。通过对PVT置管并给予AMPA受体拮抗剂6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3二酮（6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione,CNQX）,小鼠自发痒搔抓次数增加且无法被蓝光抑制。上述结果提示PVT接受来自PBN的痒信息传入,且PBN向PVT上行投射的神经通路通过PVT内AMPA受体阳性的神经元参与痒信息的传递和痒行为的调控;激活PBN向PVT上行投射的神经通路产生促痛抑痒的调控作用,且诱发焦虑样行为。3.丘脑室旁核至其传出核团神经通路参与痛、痒及负性情绪多种行为调控（1）PVT内接受PBN投射的神经元向边缘系统的边缘前皮质（PrL）、杏仁中央核（CeA）及岛叶（IC）发出纤维投射:利用顺标跨单突触病毒及Cre酶依赖的顺标病毒筛选出PrL、CeA、IC作为目标核团。随后,分别在PrL、CeA和IC内注射FG可观察到PVT向3个区域投射神经元的分布位置和特征存在差异。在PrL、CeA和IC内分别注射3种不同的逆标示踪剂可见PVT向IC及CeA分支投射的比例较高。上述形态学结果为三条通路可能存在的功能多样性奠定了形态学基础。（2）PBN-PVT-PrL/CeA/IC三条神经通路分别参与负性情绪、痒及痛行为调控:利用病毒追踪标记策略分别对PVT至不同目标区域的神经通路进行敲减,并激活PBN-PVT以观察3条神经通路在负性情绪、痒及痛中分别发挥的调控作用。结果提示PBN-PVT-CeA和PBN-PVT-IC神经通路同时参与痒或痛信息调控;PBN-PVT-PrL神经通路主要在负性情绪的形成及维持中发挥作用。（3）慢性痒、痛刺激条件下PVT内PrL、CeA、IC投射神经元的电生理特性变化:电流钳模式下,PVT内PrL投射神经元（PVTPrL神经元）及PVT内IC及CeA投射神经元（PVTIC及PVTCeA神经元）的固有兴奋性改变趋势相反。此外,PBN至PVTCeA神经元的纤维联系强度在SNI及1-氟-2,4-二硝基苯（1-fluoro-2,4-dinitrobenzene,DNFB）模型中均显著增高,而PBN至PVTIC神经元的纤维联系强度则在SNI模型中增高更为明显。上述结果提示,PBN-PVT神经通路参与痒、痛及负性情绪相关信息的传递或调控过程,其中PBN-PVT-PrL神经通路主要参与焦虑样行为的形成,PBN-PVT-CeA和PBN-PVT-IC神经通路主要参与痒及痛信息的传递或调控过程。4.丘脑中央内侧核参与痒信息传递的形态学和机能学研究（1）CM参与痒信息传递:形态学证据提示急、慢性痒均可引起CM内FOS-ir神经元的数量增加。纤维成像结果提示自由活动小鼠CM内钙信号伴随搔抓行为存在显著升高的趋势。电损毁CM后小鼠的急、慢性痒搔抓次数均显著降低,损毁组小鼠DNFB模型诱发的焦虑样行为有缓解的趋势。（2）PBN-CM神经通路参与痒信息传递:慢性痒刺激状态下活动依赖性病毒可有效标记PBN-CM神经通路。随后,在CM内注射逆标示踪剂FG,可以观察到PBN内约80%向CM投射神经元为VGluT2阳性神经元。特异性标记PBN-CM神经通路的群体钙活动变化,可见PBN-CM神经通路在痒刺激状态下神经元活动增强。利用光遗传病毒抑制PBN-CM神经通路可有效降低小鼠急性痒搔抓次数。（3）PBN-CM-mPFC神经通路参与痒信息传递及痒相关负性情绪的形成:利用病毒策略初步明确CM内接受PBN投射的神经元进一步将痒信息传导至mPFC。利用化学遗传学技术特异性兴奋或抑制CM-mPFC神经通路,结果提示激活该通路时自发痒与急、慢性痒行为均无显著改变,而抑制该通路可有效缓解急、慢性痒搔抓行为,并对慢性痒诱发的焦虑样行为具有部分缓解作用。上述结果说明PBN-CM-mPFC神经通路参与痒信息传递过程,抑制CM-mPFC神经通路可同时缓解急、慢性痒行为及慢性痒相关负性情绪。5.丘脑中央内侧核动态参与急性、慢性痒信息传递的机制（1）急、慢性痒模型中CM内mPFC投射神经元（CMmPFC）兴奋性改变:利用逆标示踪剂特异性标记CMmPFC神经元,并将光遗传病毒注入PBN。结果显示慢性痒组CMmPFC神经元的自发突触后电流增强。急、慢性痒模型中CMmPFC神经元的固有兴奋性均增强,其中DNFB组神经元的增强程度更为显著。（2）慢性痒刺激条件下CM与mPFC内中间神经元的联接增强:在CM内注射可同时标记投射纤维及突触素的顺行标记病毒,观察到CM的投射纤维同时与mPFC内锥体神经元（pyramidal neurons,PNsmPFC）及中间神经元（interneurons,INsmPFC）存在纤维联系。随后对全视野内来自CM的纤维终末进行蓝光刺激,可见在急、慢性痒刺激条件下,给光间期PNsmPFC的放电数目变化趋势相反。（3）慢性痒刺激引起CM投射纤维介导的mPFC内兴奋/抑制失衡:CM与PNsmPFC及INsmPFC均存在单突触联系,CM至PNs存在INs介导的前反馈抑制现象。同时,在急性痒刺激条件下CM至PNsmPFC的突触前囊泡释放概率显著增加;在慢性痒刺激条件下,CM至INsmPFC的兴奋性突触传递显著增强。此外,慢性痒状态下INsmPFC内NMDA电流显著升高NMDA受体拮抗剂Lanicemine可以同时缓解慢性痒搔抓行为及慢性痒相关焦虑样行为。上述结果说明在急、慢性痒刺激条件下CM与mPFC内的两类神经元存在动态联系:在慢性痒刺激条件下mPFC内的前反馈抑制增强,诱发mPFC内兴奋/抑制失衡现象。该现象可能部分由INsmPFC的NMDA电流升高所介导,NMDA受体拮抗剂Lanicemine还可同时缓解慢性痒搔抓行为及慢性痒相关负性情绪。结论:①痒信息可通过SDH向dMITC的直接传导通路、SDH至PBN和dMITC的分支投射和SDH经PBN中继再向dMITC投射的间接传导通路向dMITC传递;②PVT接受PBN的谷氨酸能兴奋性传入,PVT通过向PrL、CeA、IC等3个区域的纤维投射分别参与痛和痒信息的传递和调控以及负性情绪的产生和调控;③PBN-CM-mPFC三级神经通路参与痒信息传递,其中急性痒刺激使CM与PNsmPFC的兴奋性联系增强,主要参与痒信息传递。慢性痒刺激使CM与INsmPFC的兴奋性联系增强,可能与慢性痒相关负性情绪的形成有关。